RT-PCR是將RNA的反轉錄（Reverse Transcription，RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術(shù)，近年來(lái)得到快速發(fā)展和廣泛應用。首先，經(jīng)反轉錄酶的作用，以RNA為模板，合成互補的DNA鏈（cDNA），再以cDNA為模板，通過(guò)PCR擴增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛。獲得的cDNA可用于基因的擴增、克隆，基因表達水平的檢測，細胞內RNA病毒的含量等。
 
A．反轉錄酶（Reverse Transcriptase，RTase）
自然界中廣泛存在著(zhù)一類(lèi)以RNA為遺傳物質(zhì)的反轉錄病毒，其攜帶的反轉錄酶是一類(lèi)以RNA為模板，合成cDNA的DNA聚合酶。目前在生命科研領(lǐng)域中應用較為廣泛的有鳥(niǎo)類(lèi)成髓細胞性白血病病毒（Avian Myeloblastosis Virus，AMV）反轉錄酶（AMV RT）、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine L：Leukemin Virus，M-MLV) 反轉錄酶（M-MLV RT）及其改造重組體M-MLV（RNase H－）。AMV RT具有反轉錄活性高、zui適反應溫度較高（41～50℃）的特點(diǎn)，可以較好地克服由于模板二級結構造成的逆轉錄困難問(wèn)題，然而由于A(yíng)MV RT的RNase H活性高，易降解cDNA-RNA復合物中的RNA鏈，導致合成的cDNA片段偏短，一般為1 kb左右。M-MLV RT的RNase H活性較低，合成的cDNA可達3~4 kb，比較適宜全長(cháng)cDNA的合成。但M-MLV RT擴增效率較低，zui適反應溫度在37℃左右，故對于具有復雜二級結構的RNA模板逆轉錄效果不佳。經(jīng)過(guò)定點(diǎn)突變的M-MLV RT（RNase H－），基本上消除了RNase H酶活性，并將酶的zui適反應溫度提高到42℃，大大提高了cDNA鏈的延伸性和產(chǎn)率，更適于完整基因的獲得。我公司提供的StarScript Reverse Transcriptase（Cat. No. A211）即為經(jīng)過(guò)多重定點(diǎn)突變、具有高擴增能力的RNase H酶活性缺失型M-MLV RT，非常適合用于較長(cháng)的cDNA合成以及高比例的全長(cháng)cDNA文庫的構建等。
 
B．模板RNA
反轉錄反應中作為模板的RNA樣品可以是提取的總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產(chǎn)物。提取RNA的方法多種多樣，如單相試劑法（TRIGene，Cat. No. P118；TRIGene LS，Cat. No. P119）、過(guò)柱純化法、磁珠法等。無(wú)論使用哪種方法，zui關(guān)鍵因素是抑制RNA酶活性并zui大限度地去除基因組DNA污染。
 
C．引物
用于反轉錄的引物應視實(shí)驗的具體情況選擇。常用的引物有Oligo(dT)12-18、隨機引物(Random Hexamer)和基因特異性引物(Gene-specific primer，GSP)。對于短的不具有發(fā)卡結構的真核細胞mRNA，三種引物都可采用。Oligo (dT)12-18只適用于具有PolyA尾巴的RNA，對無(wú)PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類(lèi)的真核生物的mRNA不適用。因Oligo (dT)12-18引物需與mRNA的PolyA尾結合，所以對RNA模板的質(zhì)量要求很高，即使模板有少量降解也會(huì )影響全長(cháng)cDNA的合成量。隨機引物適用于任何類(lèi)型的RNA模板，但由于特異性低，主要用于單一模板的RT-PCR反應?；蛱禺愋砸锸歉鶕０逍蛄性O計的互補引物，特異性好，但僅適用于目的序列已知的情況。
 
D．其它影響因素
反轉錄反應受多個(gè)因素的影響，如Mg2+濃度、引物退火溫度、擴增的循環(huán)數等。對于具有較高Tm值的引物，增加退火和延伸時(shí)的溫度對反應有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。反轉錄反應的優(yōu)化參見(jiàn)“1.7 RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案“部分。
 
E．一步法和兩步法RT-PCR
RT-PCR可以通過(guò)一步法或兩步法的形式來(lái)實(shí)現。一步法即將反轉錄和PCR擴增在同一管內完成，減少加樣步驟，有助于減少污染。由于所有的cDNA產(chǎn)物都用于PCR擴增，其靈敏度非常高，尤其適用于檢測大量樣品和實(shí)時(shí)定量PCR。兩步法將反轉錄和PCR擴增分開(kāi)進(jìn)行，在選擇DNA聚合酶（如高保真度、高特異性、長(cháng)片段等）和引物時(shí)具有更大的靈活性。