聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)是基因擴增技術(shù)的一次重大革新，是分子生物學(xué)發(fā)展史中的一個(gè)重要里程碑。使用PCR擴增技術(shù)，可以將極微量的靶DNA片段特異地擴增上百萬(wàn)倍，大大提高了對DNA分子的分析和檢測能力。PCR技術(shù)具有敏感度高、特異性強、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在醫學(xué)、遺傳學(xué)、法醫學(xué)、微生物學(xué)、食品檢驗、衛生檢驗等眾多領(lǐng)域中具有巨大的應用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。
耐熱DNA聚合酶的應用是PCR技術(shù)的核心。根據是否具有3’→5’端外切酶活性，耐熱DNA聚合酶通常分為無(wú)校讀活性和有校讀活性?xún)深?lèi)。無(wú)校讀活性的DNA聚合酶(以Taq 酶為代表)具有較高的擴增效率，但由于缺乏校讀活性，容易發(fā)生堿基錯配，故產(chǎn)物中點(diǎn)突變較多。Taq DNA聚合酶還具有末端轉移酶活性，可在PCR產(chǎn)物的3’末端非特異地添加堿基，因單個(gè)A突出堿基的比例zui高，故PCR產(chǎn)物可直接與含有3’末端突出T堿基的載體連接(即TA克隆)，方便PCR產(chǎn)物的克隆、擴增和測序。然而，TaqDNA聚合酶在PCR反應*步升溫過(guò)程中即可催化錯配引物延伸或引物二聚體形成，因而導致非特異性擴增，影響目的片段的合成量。針對這一現象設計的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，在低溫時(shí)其聚合酶活性被抑制，通過(guò)高溫變性，聚合酶的活性恢復，催化特異性結合的引物擴增，因而提高了目的片段的特異性和產(chǎn)量。另一類(lèi)有校讀活性的DNA聚合酶(以Pfu為代表)可選擇性地去除錯誤摻入的dNTP，維持DNA鏈的正確延伸;然而其擴增效率通常低于Taq DNA聚合酶，特別是對于長(cháng)片段DNA鏈的延伸能力較差?；谏鲜鰞深?lèi)酶的特點(diǎn)，可將適量的Taq DNA聚合酶與任意一種有校讀活性的DNA聚合酶混合，在適當的反應緩沖液體系中，可獲得保真性與擴增性能介于上述兩類(lèi)酶之間的混合酶，用于長(cháng)片段以及復雜模板的高保真擴增。
PCR實(shí)驗受諸多因素的影響。的商業(yè)化耐熱DNA聚合酶及其配套緩沖液通?？梢詽M(mǎn)足絕大多數DNA片段擴增的需要。首先應根據模板的性質(zhì)(基因組、cDNA、質(zhì)粒等)和目的片段的大小、GC含量、有無(wú)二級結構等，選擇合適的DNA聚合酶(參見(jiàn)GenStar® PCR產(chǎn)品選擇指南)。對于難于擴增的片段，應針對不同的模板、引物，優(yōu)化反應條件，以獲得*的擴增效率(詳見(jiàn)“常規PCR反應的優(yōu)化方法)。
A. 模板用量：以50 μl反應體系為例
? 人基因組DNA：0.1~1.0 μg
? 大腸桿菌基因組DNA：10~100 ng
? λ DNA：0.5~5 ng
? 質(zhì)粒DNA：0.1~10 ng
B. 引物設計原則：
? 引物長(cháng)度要滿(mǎn)足特異性需要，一般可在18~25個(gè)堿基之間;擴增長(cháng)片段時(shí)在24~30個(gè)堿基之間;
? (G+C)%含量應盡量控制在40~60%，兩條引物的(G+C)%含量應盡量接近;
? 盡量避免相同堿基連續出現三次以上，3’端應避免使用A或T;
? 避免引物內部自身配對形成二級結構;
? 正反向引物之間應避免配對堿基，尤其是3’端的三個(gè)堿基，否則易生成引物二聚體(Primer dimer);
? 兩條引物的Tm值應盡量接近，相差不超過(guò)5oC;
? 引物Tm值的計算方法：
20 nt以下：Tm = 2x(A + T)+ 4x(G+C)
20 nt以上：Tm = 81.5+0.41x(G+C%)-600/nt(nt：引物的堿基數)
C. 引物用量：
? 0.1~1.0 μM，通?？梢?.2 μM起始，根據體系不同調整用量;
? 使用簡(jiǎn)并引物、隨機引物時(shí)，需增加引物總量以彌補產(chǎn)量損失;但隨著(zhù)引物量加大，特異性將降低;
? 模板較大較多，或結構較復雜(如人基因組DNA)時(shí)，需減少引物用量以提高特異性;
? 模板較小較少(如質(zhì)粒模板)時(shí)，增加引物用量可提高產(chǎn)量。