為什么要從化學(xué)發(fā)光轉換到熒光檢測
更新時(shí)間:2019-06-21 點(diǎn)擊次數:1560
Western blot成像方法取決于二抗的標記物,常用的方法有基于酶促反應的化學(xué)發(fā)光法,基于熒光染料的可見(jiàn)熒光方法和紅外熒光方法,那么我們應該如何選擇呢?
*合適的Western blot實(shí)驗方法取決于您期望獲得哪些信息,也就是取決于您的實(shí)驗目的,小編比較了現有方法的優(yōu)缺點(diǎn),并分享了自己的心得,希望能夠幫助您選擇到*佳的實(shí)驗方法。
化學(xué)發(fā)光方法
化學(xué)發(fā)光western blot是相對容易且靈敏度*的檢測方法,靈敏度可以達到fg級。
適用于研究:通過(guò)電泳可輕松分離的分子量差異顯著(zhù)的蛋白。
> 檢測單一蛋白
> 確定蛋白有無(wú)
> 檢測抗體反應
> 蛋白純度分析
> 檢測低豐度蛋白
優(yōu)勢 | 劣勢 |
靈敏度高 | 半定量 |
實(shí)驗流程熟悉 | 酶促反應 |
兼容膠片和數字成像系統 | 一次只能檢測單一信號 |
| 需要玻璃和重孵育 |
| 膠片沒(méi)有過(guò)飽和提醒 |
熒光檢測方法
熒光染料分為可見(jiàn)熒光染料和紅外熒光染料,從而將熒光western blot檢測分為可見(jiàn)熒光檢測和紅外熒光檢測。目前可見(jiàn)熒光檢測*多三個(gè)通道,可以同時(shí)檢測三種不同的蛋白,近紅外檢測*多為兩個(gè)通道,一定選擇激光光源激發(fā)的哦,更接近近紅外染料的*大發(fā)射波長(cháng)680nm和800nm,增強二抗信號,提高檢測的靈敏度。
熒光Western blot使用熒光染料標記的二抗進(jìn)行檢測,膜上的靶標蛋白濃度與可見(jiàn)熒光信號強度呈線(xiàn)性關(guān)系,實(shí)現真實(shí)可靠的定量分析。熒光染料發(fā)射光譜不同,因此在一張印跡膜上可實(shí)現多重檢測。在無(wú)需剝離和重孵育條件下,進(jìn)行上樣量質(zhì)控,可以分析翻譯后修飾蛋白。
因此當您進(jìn)行如下實(shí)驗室,選擇熒光檢測方法,妥妥的:
> 同時(shí)檢測多種蛋白
> 研究翻譯后修飾蛋白
> 同一印跡膜的上樣質(zhì)控
> **定量western blot實(shí)驗
優(yōu)勢 | 劣勢 |
可進(jìn)行多重檢測 | 膜會(huì )有自發(fā)熒光 |
定量 | |
信號持久穩定 | |
實(shí)驗方法不需改變太多 | |
期刊雜志要求:
例如nature中“Image Integrity and Standards”中鼓勵在一張印跡膜上進(jìn)行內參和目的蛋白的的檢測,同時(shí)使用合理的標準化方法:例如:全蛋白歸一化。
化學(xué)發(fā)光屬于酶促反應,動(dòng)態(tài)范圍窄,只能實(shí)現定性分析,一次只能檢測一個(gè)信號,如要檢測多個(gè)信號,需要剝離和重孵育,如使用膠片成像,還需要反復摸索曝光時(shí)間,顯影定影設備和設備的維護,熒光檢測可同時(shí)滿(mǎn)足期刊雜志發(fā)表要求、一次可進(jìn)行多個(gè)信號檢測,反應條件一致,jingzhun定量,特別近紅外熒光檢測方法,具有低背景,高信噪比,是現在western blot熒光定量的金標準。