一、凝膠制備
1.微波爐溶解瓊脂糖時(shí),膠液沸騰沖溢出三角錐瓶微波爐加熱時(shí)膠液可能發(fā)生劇烈沸騰,
1)總液體量不宜超過(guò)三角錐瓶的 50% 容量,
2)2% 以上膠液設置中火加熱
3)膠液劇烈沸騰時(shí),停止加熱,移開(kāi)三角錐瓶,請戴上防熱手套,小心搖動(dòng)三角錐瓶,然后再次加熱,膠液沸騰直至膠液清澈,保證瓊脂糖*溶解。
2.瓊脂糖電泳圖像背景模糊不清
瓊脂糖沒(méi)有*溶解會(huì )造成電泳圖像背景模糊不清。 *溶解的瓊脂糖膠液清澈,三角錐瓶?jì)缺趹獩](méi)有粘附瓊脂糖顆粒。
3.加熱后水分蒸發(fā),如需要應加入熱的蒸餾水,補足到原來(lái)的重量,搖勻。
二、 電泳
1.DNA 條帶模糊,拖尾
1) DNA 降解。避免核酸酶污染。
2)DNA 上樣量過(guò)多。減少凝膠中 DNA 上樣量。
3) 電泳緩沖液陳舊: 電泳緩沖液多次使用后,離子強度降低, pH 值上升,緩沖能力減弱,從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。
4)電泳條件不合適。電泳時(shí)電壓不應超過(guò) 20V/cm ,溫度<30 ℃ ,巨大 DNA 鏈,溫度應<15 ℃,核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。
5)DNA 樣含鹽過(guò)高。泳前通過(guò)乙醇沉淀去除過(guò)多的鹽。
6)有蛋白污染。電泳前抽提去除蛋白。
7)DNA 變性。電泳前勿加熱,用 20mM NaCl 緩沖液稀釋 DNA 。
2.DNA 條帶淡弱或無(wú) DNA 帶
1)DNA 的上樣量不夠:增加 DNA 的上樣量。
2)DNA 降解:避免 DNA 的核酸酶污染。
3)DNA 走出凝膠:縮短電泳時(shí)間,降低電壓,增強凝膠濃度。
4)分子大小相近的 DNA 帶不易分辨。增加電泳時(shí)間,使用正確的凝膠濃度。
5)DNA 變性:電泳前請勿高溫加熱 DNA 鏈,用 20mM NaCl Buffer稀釋DNA 。
6)DNA 鏈巨大,常規凝膠電泳不合適。在脈沖凝膠電泳上分析。
3.DNA MARKER 條帶扭曲
1)配制凝膠的緩沖液和電泳緩沖液不是同時(shí)配制的。使用同時(shí)配制的緩沖液。電泳時(shí)緩沖液高過(guò)液面1 - 2mm 即可。
2)電泳時(shí)電壓過(guò)高??梢栽陔娪厩?15 分鐘用較低電壓 (3V/cm), 等條帶出孔后,再調電壓。
3)盡量慢慢加樣 ,等樣品自然沉降后再加電壓。