在檢測RNA樣本時(shí)，需確保比色杯中去除了RNA酶，特別是在使用分光光度測定之后仍需回收這些RNA的情況下。該條件可通過(guò)使用0.1 M NaOH，1mM EDTA和不含RNase的水的順序洗滌來(lái)實(shí)現。使用稀釋RNA的緩沖液為分光光度計設定空白對照。

在使用紫外通透的塑料比色杯的分光光度計中，測量260 nm的吸光值(A260)以確定RNA的濃度。為了確保獲得有意義的結果，讀值應在0.15與1.0之間。在260 nm波長(cháng)下，1個(gè)單位的吸光值對應每毫升44 μg的RNA濃度（A260=1 → 44 μg/ml；基于標準的1 cm測光距離）。這一相關(guān)性?xún)H對中性pH值條件下的檢測有效。因此，如需稀釋RNA樣品，則應使用中性pH值的低鹽緩沖液（例如10 mM Tris?Cl ，pH7.0）。

在檢測RNA樣本時(shí)，需確保比色杯中去除了RNA酶，特別是在使用分光光度測定之后仍需回收這些RNA的情況下。這可以通過(guò)使用0.1 M NaOH，1mM EDTA和不含RNase的水的順序洗滌來(lái)實(shí)現。使用稀釋RNA的緩沖液為分光光度計設定空白對照。列舉一個(gè)RNA定量中的計算實(shí)例如下：

RNA定量舉例
RNA樣品的體積= 100 μl
稀釋=10 μl RNA樣品+490μl 10 mM Tris?Cl ，pH 7.0（1/50的稀釋比）
使用1 ml（已去除RNA酶）比色杯，檢測稀釋后樣本的吸光度
A260 = 0.2

RNA濃度
= 44 μg/ml x A260 x稀釋系數
= 44 μg/ml x 0.2 x 50 
= 440 μg/ml

RNA總量 
=濃度x以毫升為單位的樣品體積
= 440 μg/ml x 0.1 ml 
= 44 μg RNA

RNA純度

在260 nm與280 nm讀值之間的比例（A260/A280）能夠反映RNA的純度，因為如蛋白一類(lèi)的污染物會(huì )吸收紫外光。不過(guò)，A260/A280的比值也受到pH值的顯著(zhù)影響。當使用沒(méi)有緩沖能力的水時(shí)，pH值與A260/A280的比值結果都會(huì )發(fā)生大范圍的改變。 較低的pH值會(huì )導致A260/A280的比值變小，對蛋白質(zhì)污染的敏感性也會(huì )隨之降低（3）。

為了獲得的比率，我們建議在微堿的低鹽緩沖液中檢測吸光度（例如10 mM Tris?Cl，pH7.5）。在10 mM Tris?Cl，pH 7.5緩沖液當中，純RNA的A260/A280 比率約為1.9–2.1。

注：某些分光光度計在檢測純RNA時(shí)，可常規獲得高達2.3的比值。

請確保使用同種溶液校準分光光度計。不過(guò)，為了準確確定RNA的濃度，我們仍建議使用中性緩沖液稀釋RNA樣本，因為吸光度和濃度（A260讀值為1相當于44 μg/ml的RNA濃度）之間的關(guān)系是一個(gè)基于中性條件獲得的吸光系數。

RNA的完整度

總RNA的完整度和大小分布可以通過(guò)變性的瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色或市售的檢測系統（如QIAxcel系統或Agilent 2100 ）進(jìn)行檢測。每條核糖體RNA的富集區域在凝膠染色之后應顯現為銳利的條帶。28S核糖體RNA的條帶亮度應為18S rRNA條帶的兩倍左右。如果某一泳道中核糖體RNA條帶不夠銳利，卻出現小尺寸RNA的彌散情況，則很可能因為RNA樣品在制備過(guò)程中發(fā)生了嚴重的降解。

Agilent 2100 Bioanalyzer也能夠提供RNA完整數目（RNA Integrity Number，RIN）這一參數，作為對RNA完整度的一個(gè)有用量度。在理想情況下RIN值應接近10，不過(guò)在許多情況下（特別是對組織樣本來(lái)說(shuō)），RNA品質(zhì)主要取決于原始樣本的保存情況。

不同來(lái)源的核糖體RNA大小

變性凝膠分析的原理

利用RNA在甲醛瓊脂糖凝膠中的電荷遷移效應，可對RNA進(jìn)行分離和鑒定。RNA不像DNA，它們具有復雜的二級結構，因此需使用變性凝膠。凝膠中的甲醛能夠破壞RNA的二級結構，從而使得RNA分子嚴格按照電荷遷移的方式得到有效分離。

在電場(chǎng)中，主鏈磷酸基團上所攜帶的負電荷使核酸分子向陽(yáng)極移動(dòng)。變性的RNA分子的遷移速率取決于它們的尺寸大??；不過(guò)片段大小與遷移速率之間并非線(xiàn)性相關(guān)，因為更大的片段會(huì )遇到更大的摩擦阻力，在凝膠中移動(dòng)更為困難。

瓊脂糖凝膠分析是zui為常用的RNA分析方法，通常依據RNA的大小相應選擇合適分辨范圍的瓊脂糖凝膠。小的RNA片段，如tRNA或5S rRNA，可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析?？刹殚喎肿由飳W(xué)手冊（2,4）以獲得關(guān)于各類(lèi)分析膠的詳細信息。本節將針對甲醛瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行介紹。

制備用于RNA分析的甲醛瓊脂糖凝膠

下列甲醛瓊脂糖（FA）凝膠電泳方案能夠提高凝膠分離及后續檢測（例如RNA印跡）的靈敏度。本方案的關(guān)鍵特點(diǎn)在于使用了濃縮的RNA上樣緩沖液，從而（相比傳統實(shí)驗方案）能夠向凝膠中載入更大量的RNA樣本。

瓊脂糖

用于制備凝膠的瓊脂糖是針對所分離RNA片段的大小來(lái)確定濃度范圍的。對于大多數的目的RNA種類(lèi)來(lái)說(shuō)，使用1.0–1.2%（質(zhì)量體積比）的瓊脂糖濃度可獲得*結果。對于較大的mRNA種類(lèi)，降低瓊脂糖濃度可能會(huì )有所幫助。如需分離更小的mRNA，瓊脂糖濃度可提高至2%。對于較小的RNA種類(lèi)，如tRNA或rRNA，則推薦使用聚丙烯酰胺凝膠電泳。

請使用超純瓊脂糖，因為如多糖類(lèi)、鹽類(lèi)和蛋白一類(lèi)的雜質(zhì)都會(huì )對RNA的遷移造成影響。

小貼士：某些電泳槽的塑料不耐乙醇。請對此適當留意，并核對廠(chǎng)商的說(shuō)明書(shū)。

Total RNA-甲醛瓊脂糖凝膠

每個(gè)泳道10ug RNA