起始材料的有效破碎和勻漿對于所有總RNA分離操作來(lái)說(shuō)都是必須的要求。破碎和勻漿是兩個(gè)獨立分開(kāi)的步驟。

• 破碎：對于組織結構、細胞壁和細胞質(zhì)膜的*破碎對于釋放樣本中所有的RNA是必要的。不同樣本需要使用不同的方法以達到*的破碎效果。不*的破碎會(huì )導致RNA得率的顯著(zhù)降低。
• 勻漿：勻漿對于減少破碎后細胞裂解產(chǎn)物的粘性是十分必要的。勻漿能夠切斷高分子量的基因組DNA及其他高分子量的細胞組分，得到均勻的裂解產(chǎn)物。勻漿不夠*會(huì )導致RNA結合效率的下降而顯著(zhù)降低得率。

某些破碎方法能夠同時(shí)對樣本起到勻漿作用，而其他方法還是需要專(zhuān)門(mén)的勻漿步驟。表針對不同樣本進(jìn)行破碎和勻漿的準則全面概述了適用于多種起始材料的不同破碎和勻漿方法。當您針對所使用的起始材料選擇合適的操作方法時(shí)，該表格可用來(lái)作為參考。下面也將針對破碎和勻漿方法進(jìn)行更為詳細的論述。

使用玻珠研磨機進(jìn)行破碎和勻漿

在使用玻珠研磨機破碎樣本的過(guò)程中，樣本與珠子被一起進(jìn)行高速攪拌。通過(guò)珠子與細胞碰撞時(shí)的流體動(dòng)力切割和破碎作用，同步完成破碎和勻漿過(guò)程。破碎效率的影響因素有：

• 珠子的大小和組成
• 緩沖液與珠子的比例
• 起始樣本的數量
• 攪拌速度和設定
• 處理時(shí)間

細菌破碎時(shí)所使用的理想珠型為0.1毫米（平均直徑）的玻璃珠，用于酵母和單細胞動(dòng)物細胞時(shí)為0.5毫米的玻璃珠，對動(dòng)植物組織則應使用3–7毫米的不銹鋼珠。請確保玻璃珠經(jīng)過(guò)濃硝酸的預先潤洗?；蛘呖芍苯淤徺I(mǎi)和使用市售的經(jīng)酸洗滌過(guò)的玻璃珠。關(guān)于破碎的其他參數需要依據每一應用的經(jīng)驗進(jìn)行設定。植物材料以及相關(guān)的珠子和破碎管可先在液氮中預冷，破碎應在無(wú)裂解緩沖液的條件下進(jìn)行。對于動(dòng)物組織則應使用干燥的冷凍粉碎。冷凍粉碎（無(wú)論是在玻珠研磨機中還是使用研缽和杵）不同于緩沖液裂解，不會(huì )對樣本同時(shí)起到勻漿作用。

使用轉子——定子勻漿器進(jìn)行破碎和勻漿

在裂解緩沖液的存在下，轉子–定子勻漿機可同時(shí)完成對動(dòng)物組織的*破碎和勻漿，所需時(shí)間基于樣本的堅韌程度，可在5–90秒內完成。轉子–定子勻漿機也可以用于細胞裂解產(chǎn)物的勻漿。轉子的超高速旋轉能夠以擾動(dòng)和機械剪切的綜合方式，完成對樣本的破碎和勻漿。使用適當大小的管子，在勻漿過(guò)程中始終保證勻漿器頭部一直處于浸沒(méi)狀態(tài)，并持續將勻漿器頭部伸入管子末端，以確保勻漿過(guò)程中樣本內的泡沫達到zui少。轉子–定子勻漿機有不同大小型號可供選擇，并可裝配不同大小的探頭。5 mm和7 mm的探頭適合在300 μl以下的體積內使用，并可用于離心管內的勻漿。10 mm及以上尺寸的探頭則適用于更大的管子。

使用研缽和杵破碎

使用研缽和杵破碎時(shí)，先將樣本進(jìn)行迅速的液氮冷凍，并在液氮中將其研磨為細粉。將上清液（組織粉末和液氮）轉移至液氮預冷的適當大小的管中，使液氮揮發(fā)但不要讓樣品融解。加入裂解緩沖液，并盡可能快地進(jìn)行后續步驟。

注：使用研缽和杵研磨樣品會(huì )破碎樣品，但無(wú)法達到勻漿的目的。勻漿作用需與此步驟分開(kāi)進(jìn)行。

使用注射器和針頭完成勻漿

細胞和組織的裂解產(chǎn)物可以使用注射器和針頭進(jìn)行勻漿?？梢允褂?0號（0.9 mm）針頭連接一個(gè)滅菌塑料注射器，通過(guò)至少5–10次的吹打切斷高分子量的DNA，直至裂解產(chǎn)物的勻漿形成。為操作便利和減少樣品損失，也可能需要增加裂解緩沖液的體積。

一些樣本來(lái)源在其RNA或內含物方面存在著(zhù)顯著(zhù)不同，可能導致RNA的分離和分析過(guò)程出現問(wèn)題。當操作這些樣本來(lái)源時(shí)需要一些特別注意事項。本節將針對大量不同樣本來(lái)源的操作進(jìn)行探討。

植物

從植物材料中分離RNA會(huì )遇到一些特殊困難，常規技術(shù)在用于植物樣本之前一般要先經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化。一些植物代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)與核酸相似，導致其難于從RNA制備產(chǎn)物中除去。（使用不當的）純化方法（如鹽類(lèi)或苯酚）所導致的代謝物（例如多糖類(lèi)、多酚類(lèi)和黃酮類(lèi)）或污染物與目的RNA的共分離，可能造成對酶促反應的抑制，或導致紫外分光光度測定和凝膠電泳結果上的偏差。從植物材料中分離RNA的過(guò)程中可能遇到的困難還包括由于較高粘性導致的吸取體積錯誤，以及儲存過(guò)程中的RNA降解問(wèn)題。

通常對植物的生長(cháng)條件進(jìn)行優(yōu)化，使其不產(chǎn)生高水平的植物代謝產(chǎn)物，可有助于對RNA的有效分離。由于植物種類(lèi)之間存在較大差異，因此對其生長(cháng)條件很難有同一的指導標準。不過(guò)作為普適原則，建議盡可能使用健康幼嫩的植物組織。年輕植物組織的RNA得率通常高于年老組織，因為前者在等重條件下通常比后者包含更多的細胞。而且等重的年輕組織通常也包含更少的代謝物。此外，許多“自定義"的RNA分離方法都推薦將植物組織在黑暗中培養1–2天后再進(jìn)行收獲，以避免形成植物代謝物的高水平積累。

心臟、肌肉和皮膚組織

從例如骨骼肌、心臟和皮膚組織一類(lèi)的樣本中分離RNA可能比較困難，因為此類(lèi)樣品中含有大量的收縮性蛋白、結締組織和膠原。為了去除這些可能對RNA分離造成干擾的蛋白，需要使用蛋白酶或含苯酚的裂解試劑對此類(lèi)樣本進(jìn)行處理。不過(guò)，蛋白酶的消化過(guò)程需要避免RNA發(fā)生降解。

細菌

細菌mRNA的很多基本特征都不同于真核生物的mRNA。原核生物的mRNA沒(méi)有5’帽子，也很少具有poly A尾。缺少poly A尾的mRNA無(wú)法通過(guò)雜交進(jìn)行捕獲。另外，也無(wú)法在合成初始鏈的過(guò)程中使用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷（oligo–dT）引物，只能使用隨機引物作為替代。

此外，細菌RNA也十分地不穩定，快速生長(cháng)的品種中RNA的平均半衰期約為3分鐘。某些細菌的mRNA在翻譯同時(shí)即發(fā)生降解。因此對于嘗試從細菌中分離mRNA的研究人員來(lái)說(shuō)，這可算是一個(gè)麻煩。也由于細菌中的mRNA的周轉（從生成到降解）非?？?，造成原核生物的基因表達研究比真核生物更為困難。為了地保留基因表達譜，并使完好mRNA的得率zui大化，在樣本獲取和加工之前需要對其進(jìn)行穩定處理。

血液

血液直接源于臨床分析的收集樣本。在收集管中使用RNA穩定處理試劑可成功保存血液樣本的RNA。從血液中分離RNA的方法，需要能夠確保生成無(wú)污染物或酶抑制劑的高質(zhì)量RNA。血液中所含有的大量酶抑制劑會(huì )對下游的RNA分析造成干擾。此外，如肝素和EDTA等一類(lèi)常規的抗凝血劑也會(huì )干擾下游分析。應注意抗凝血劑并不會(huì )對RNA起到穩定化作用。

人類(lèi)血液中的紅血球（血紅細胞）不含細胞核，因此不會(huì )合成RNA；通常情況下這類(lèi)細胞僅含有非常微量的RNA，而不是RNA分離的主要對象。從全血中分離RNA的主要靶標細胞為白血球（白細胞），這類(lèi)細胞含有細胞核和RNA。白血球由三種主要的細胞類(lèi)型構成：淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。

由于健康的血液中所含的紅細胞數量約為白細胞的1000倍，去除紅細胞會(huì )有助于簡(jiǎn)化RNA分離步驟?？赏ㄟ^(guò)選擇性地裂解紅細胞來(lái)達到此目的，因為紅細胞對低滲休克更為敏感（相比白血球），在低滲緩沖液中會(huì )迅速發(fā)生破裂。

裂解紅細胞的另一種常見(jiàn)替代方法是Ficoll密度——梯度離心法。與紅血球裂解法不同，Ficoll密度——梯度離心法僅獲取單核的細胞（淋巴細胞和單核細胞），而會(huì )去除粒細胞。經(jīng)Ficoll密度––梯度離心法分離出的單核細胞能夠使用與其他動(dòng)物細胞一樣的方法進(jìn)行RNA分離。

FFPE組織樣品

福爾馬林固定，石蠟包埋(FFPE)的組織樣本是生物醫學(xué)研究中的重要和廣泛的樣本來(lái)源。越來(lái)越多的研究者開(kāi)始針對FFPE樣本開(kāi)始分子水平的分析，因此考慮這些樣本的*屬性以發(fā)展針對性的分離方法變得越來(lái)越重要。

由于在固定和包埋過(guò)程中使用了甲醛，通常會(huì )使FFPE樣本中的核酸發(fā)生嚴重的片段化和化學(xué)改變。因此，從FFPE樣本中分離到的核酸會(huì )比新鮮樣本或冰凍樣本的分子量更低。其片段化程度基于樣本類(lèi)型、保存期長(cháng)短，以及固定、包埋和儲存的條件而發(fā)生變化。盡管在凝膠電泳或芯片實(shí)驗室（lab–on–a–chip）分析等標準質(zhì)量控制分析中無(wú)法測得甲醛修飾情況，但后者實(shí)際會(huì )對酶學(xué)分析造成嚴重干擾。

為了將FFPE儲存法對RNA轉錄物的影響降至zui低，應牢記下列小貼士：

• 盡可能快地取樣和固定組織
• 不要使用厚度超過(guò)5 mm的樣本，樣本固定時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)（zui長(cháng)24小時(shí)）
• 使用的試劑進(jìn)行石蠟包埋，不要加入其它添加劑
• 盡可能避免對樣本進(jìn)行染色
• 適當地儲存FFPE樣本（RNA在4°C可完好保存至1年，優(yōu)于保存在室溫或更高溫度）
• 使用適當的脫石蠟步驟
• RNA分離應包含一個(gè)解交聯(lián)的步驟

純RNA可以?xún)Υ嬖讪C20°C或–70°C的不含RNase的水中。在上述條件下，1年內都不會(huì )發(fā)生RNA降解。