那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下三種紫外吸收法測蛋白質(zhì)含量。

1. 280nm的光吸收法
因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有**大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是**常用的紫外吸收法。
測定時(shí)，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值a280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.1～1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標準石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，a280約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質(zhì)的大致濃度。
許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(cháng)下的光吸收值（A1％1cm）有文獻數據可查，根據此光吸收值可以較準確地計算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A1％1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系。文獻值A1％1cm，稱(chēng)為百分吸收系數或比吸收系數。
蛋白質(zhì)濃度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)
(q 1%濃度  10mg/ml)
例：牛血清清蛋白 ： A1％1cm=6.3 (280nm)
溶菌酶 ：   A1％1cm=22.8 (280nm)
若查不到待測蛋白質(zhì)的A1％1cm值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標準蛋白質(zhì)，用標準曲線(xiàn)法進(jìn)行測定。標準蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標準蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（BSA）。
標準曲線(xiàn)的測定：取6支試管，按下表編號并加入試劑：
管號 1 2 3 4 5 6
BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
A280
用第1管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度A280，以A280為縱座標，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標作圖，標準曲線(xiàn)應為直線(xiàn)，利用此標準曲線(xiàn)，根據測出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用2至6管A280值與相應的試管中的蛋白質(zhì)濃度計算出該蛋白質(zhì)的A1％1cm，280nm
2. 280nm和260nm的吸收差法
核酸對紫外光有很強的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：
純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260  = 1.8
純核酸的光吸收比值： A280/A260 = 0.5
含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280－0.74×A260
此經(jīng)驗公式是通過(guò)一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數據來(lái)建立的。
3. 215nm與225nm的吸收差法
蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時(shí)，可用215nm與225nm吸收值之差，通過(guò)標準曲線(xiàn)法來(lái)測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。
用已知濃度的標準蛋白質(zhì)，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，并計算出吸收差：
吸收差d= A215 －A225
以吸收差d為縱座標，蛋白質(zhì)濃度為橫座標，繪出標準曲線(xiàn)。再測出未知樣品的吸收差，即可由標準曲線(xiàn)上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。

以上就是上海金鵬分析儀器有限公司為大家整理總結關(guān)于三種紫外吸收法測蛋白質(zhì)含量。
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