（一）原 理
由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制，因此可以形成“連續系統”和“不連續系統”兩種電泳系統。“不連續系統”大的特點(diǎn)在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點(diǎn)是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統；（2）配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同，并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分、pH也不相同。在實(shí)驗中，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠，稱(chēng)為濃縮膠或成層膠，配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl，pH6.7；下層膠則是高濃度的小孔膠，稱(chēng)為分離膠或電泳膠，成膠的緩沖液是Tris-HCl，pH8.9。電泳槽中的電極緩沖液則是Tris-甘氨酸，pH8.3?？梢?jiàn)，凝膠濃度、成膠成分、pH與電泳液緩沖系統各不相同，形成了一個(gè)不連續系統。
電泳時(shí)，蛋白質(zhì)樣品放置在濃縮膠上，為防止蛋白質(zhì)樣品在電極緩沖液中擴散，因而加入等體積的40%蔗糖或50%甘油與之混合，以提高密度；為觀(guān)察蛋白質(zhì)樣品泳動(dòng)的情況，樣品中還加入溴酚藍等示蹤染料，這些有色物質(zhì)的分子比任何一種大分子物質(zhì)泳動(dòng)的速度都快，只要染料未泳動(dòng)出凝膠管，樣品就沒(méi)有走出膠管的危險。
在不連續系統中，當接通電源開(kāi)始電泳時(shí)，系統中的甘氨酸、蛋白質(zhì)、HCl中的氯離子和溴酚藍等均解離為陰離子，形成離子流向陽(yáng)極泳動(dòng)。其遷移率取決于離子的電荷數、分子量大小及形狀。然而，當電極緩沖液（pH8.3）中的甘氨酸離子在進(jìn)入濃縮膠時(shí)，它們遇到了比pH8.3低的pH（6.7），pH下降了近兩個(gè)單位，幾乎接近于甘氨酸的等電點(diǎn)（5.97），于是甘氨酸的解離度突然降低，所帶電荷量明顯減少，遷移率減慢。血清樣品中個(gè)蛋白質(zhì)成分也進(jìn)入濃縮膠，pH的改變雖對其解離度有影響，但比對甘氨酸要小得多，其遷移率比甘氨酸要大，而且濃縮膠的膠孔較大對蛋白質(zhì)分子不會(huì )造成阻礙。濃縮膠中的Tris-HCl中的Cl-則全部解離，分子量很小，摩擦力不大，其遷移率比蛋白質(zhì)、溴酚藍都快。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成：甘氨酸<蛋白質(zhì)<溴酚藍
甘氨酸分子進(jìn)入濃縮膠后解離度的下降，造成移動(dòng)離子流的突然缺失，出現電流減小電導率下降。然而，整個(gè)電泳系統中其他部分的電流仍維持不變，根據電導及電位梯度成反比（E=I/n，E為電位梯度，I為電流強度，n為電導率）的關(guān)系，于是在前導離子Cl-離子與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度。處在這個(gè)局部高電位梯度區域中的血清蛋白質(zhì)各成分，在高電場(chǎng)作用下迅速以不同的速度（分子量不同、帶電量不同）泳向前導Cl-離子區域。當到達前導Cl-區域時(shí)因不缺少離子，大的電場(chǎng)強度減弱，離子移動(dòng)速度急速減慢下來(lái)，其結果在甘氨酸和Cl-離子之間的蛋白質(zhì)樣品就按其分子的大小堆積或濃縮成層。通過(guò)這個(gè)過(guò)程，是蛋白質(zhì)樣品濃縮了好幾百倍，且蛋白質(zhì)各成分也按一定的順序排列成層。
當離子流繼續向前，進(jìn)入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時(shí)，蛋白質(zhì)分子在小孔膠里遇到阻力，遷移率減慢，同時(shí)在pH8.9條件下，甘氨酸又充分解離，其帶電量增加，消除了離子流缺失的現象，小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質(zhì)。凝膠各部分恢復具有恒定的電場(chǎng)強度，蛋白質(zhì)的分離*按一般區帶點(diǎn)用方式進(jìn)行。
由以上的原理可見(jiàn)，聚丙烯酰胺凝膠的不連續電泳主要的優(yōu)點(diǎn)就是使蛋白質(zhì)樣品經(jīng)濃縮膠后，形成緊密地壓縮層進(jìn)入分離膠。蛋白質(zhì)各成分預先分開(kāi)且壓縮成層，可以減少在電泳時(shí)，成分間由于自由擴散而造成的區帶相互重疊所帶來(lái)的干擾，這樣就提高了電泳的分辨能力。由于這個(gè)優(yōu)點(diǎn)，少量的蛋白質(zhì)樣品（1-100??g）也能分離得很好，分辨率高使血清蛋白質(zhì)可獲得近20多個(gè)區帶。

（二）試劑和器材
1．測試樣品 血清蛋白、脫鹽后的IgG、純化后的IgG。
2．試劑
（1）制備分離膠、濃縮膠有關(guān)試劑
① 凝膠緩沖液：稱(chēng)取1mol/L HCl 48ml，Tris（三羥基氨基甲烷）36.6g，TEMED（N，N，N`，N`-四甲基乙二胺）0.23ml，加重蒸水至80ml使其溶解，調pH8.9，然后加重蒸餾水定容至100ml，置棕色瓶，4℃貯存。
② 分離膠貯液：28%Arc-0.735%Bis儲液：丙烯酰胺（Acr）28.0g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.735g，加重蒸水使其溶解后定容至100ml。過(guò)濾后置棕色試劑瓶中，4℃ 貯存，一般可放置1個(gè)月左右。
③ 分析純過(guò)硫酸胺（AP）（AR） 0.14g加重蒸水至100ml，置棕色瓶，4℃儲存僅能用一周，好當天配制。上述3種試劑用于制備分離膠。
④ 濃縮膠緩沖液：稱(chēng)取1mol/L HCl 48ml，Tris5.98g，TEMED 0.46ml，加重蒸水至80ml,調pH6.7，用重蒸水定容至100ml，置棕色瓶?jì)龋?℃貯存。
⑤ 濃縮膠貯液：稱(chēng)Acr10g，Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml，過(guò)濾后置棕色瓶?jì)龋?℃貯存。
⑥ 40%蔗糖溶液（W/V）
⑦核黃素溶液 核黃素4.0mg，加重蒸餾水溶解，定容至100ml，置棕色試劑瓶?jì)龋?℃貯存。

（2）Ph8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液
稱(chēng)Tris6.0g，甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900ml，調pH8.3后，用重蒸水定容至1000ml，置試劑瓶中，4℃貯存，臨用前稀釋10倍。
（3）0．1%溴酚藍指示劑
（4）染色液 染色液種類(lèi)較多，染色方法也不*相同。本實(shí)驗采用0.05%考馬斯亮藍R250染色液中，含20%磺基水楊酸，其優(yōu)點(diǎn)是染色、固定同時(shí)進(jìn)行，背景易脫色。0.5%考馬斯亮藍R250的20%磺基水楊酸染色液：考馬斯亮藍0.05g，磺基水楊酸20g，加蒸餾水至100ml，過(guò)濾后置試劑瓶?jì)缺４妗?/span>
（5）脫色液 7%乙酸溶液
（6）保存液 甘油10ml，冰乙酸7ml，加蒸餾水至100ml。
（7）1%瓊脂（糖）溶液   瓊脂（糖）1g，加已稀釋10倍的電極緩沖液，加熱溶解，4℃貯存，備用。
3．器材   電泳儀 夾心式垂直板電泳槽。

（三）操作方法
1．安裝夾心式垂直板電泳槽
夾心式垂直板電泳槽操作簡(jiǎn)單，不易滲漏。這種電泳槽兩側為有機玻璃制成的電極槽，兩個(gè)電極槽中間夾有一個(gè)凝膠模，該模由一個(gè)上框形凝膠框、長(cháng)與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。電泳槽由上儲槽（白金電極在上或面對短玻璃板），下儲槽（白金電極在下或面對長(cháng)玻璃板）和回紋狀冷凝管組成。兩個(gè)電極槽與凝膠模間靠?jì)σ翰勐萁z固定。各部間依下列順序組裝：
（1）將上儲槽和固定螺絲銷(xiāo)釘，仰放在桌面上。
（2）將上、短玻璃板分別插到上框形硅橡膠的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。
（3）將已插好玻璃板的凝膠模平放在上儲槽上，短玻璃板應面對上儲槽。
（4）將下儲槽的銷(xiāo)孔對準已裝好螺絲銷(xiāo)釘的上儲槽 ，雙手以對角線(xiàn)的方式旋緊螺絲帽 。
（5）豎直電泳槽，在長(cháng)玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內加入已融化的1%瓊脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂（糖）中應避免有氣泡。

2．配膠
① 分離膠 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中，凝膠緩沖液（pH8.9）2.5ml，分離膠貯液5.0ml，重蒸餾水2.5ml，充分混勻，抽氣10min，后加AP 10 ml。
② 濃縮膠 pH6.7 25% PAA：濃縮膠緩沖液∶濃縮膠貯液∶40%蔗糖溶液∶核黃素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。

3．制備凝膠板
不連續體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠 ，凝膠制備應分2步進(jìn)行。
① 分離膠的制備：根據實(shí)驗要求，選擇終丙烯酰胺的濃度，本實(shí)驗需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液，其加膠方式不同于連續系統?；旌虾蟮哪z溶液，用細長(cháng)頭的滴管加至長(cháng)、短玻璃板間的窄縫內，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1cm注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水（約3-4mm）用于隔絕空氣，使膠面平整。為防止滲漏，在上、下儲槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30-60min凝膠*聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線(xiàn)。用濾紙條吸去多余的水，但不要碰破膠面。如需預電泳，則上、下儲槽的蒸餾水倒去，換上分離膠緩沖液，10mA電流電泳1h，終止電泳后，棄去分離膠緩沖液，用注射器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數次，即可制備濃縮膠。
② 濃縮膠制備：濃縮膠為pH6.7 25% PAA，混合均勻后用細長(cháng)的滴管將凝膠溶液加到長(cháng)、短玻璃板的窄縫內（即分離膠上方），距短玻璃板上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。在上、下儲槽中加入蒸餾水，但不能超過(guò)短玻璃板上緣。在距離電極槽10cm處，用日光燈或太陽(yáng)照射，進(jìn)行光聚合，但不要造成大的生溫。在正常情況下，照射6-7min，則凝膠由蛋黃透明變成乳白色，表明聚合作用開(kāi)始。繼續光照30min，使凝膠聚合*。光聚和完成后放置30-60min，輕輕取出樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體，加入稀釋10倍pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液。使液面沒(méi)過(guò)玻璃板約0.5cm，即可加樣。
4．加樣
作為分析用的PAGE加樣量?jì)H需幾微克，2-3ul血清電泳后就能分出幾十條蛋白區帶。為防止樣品擴散，應在樣品中加入等體積40%蔗糖（內含少許溴酚蘭）。用微量注射器取5ul上述混合液，通過(guò)緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內都加了樣品，即可開(kāi)始電泳。
5．電泳
將直流穩壓電泳儀的正極與下槽連接，負極與上槽連接（方向切勿接錯）。接通冷卻水，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)將電流調至10 mA 。待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)將電流調至20-30mA。當藍色染料遷移至距離橡膠框下緣1cm時(shí)，將電流調回到零，關(guān)電源及冷卻水。分別收集上、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中，4℃貯存還可用1-2次。旋松固定螺絲，取出硅橡膠框，用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開(kāi)移去，在膠板一端切除一角作為標記，將膠板移至大培養皿中染色。
6．固定，染色
本實(shí)驗采用0.05%考馬斯亮藍R250（內含20%磺基水楊酸）染色液，染色與固定同時(shí)進(jìn)行，使染色液沒(méi)過(guò)膠板，染色30min左右。
7．脫色
用7%乙酸侵泡漂洗數次，直至背景藍色褪去。如用50℃水浴或褪色搖床，則可縮短褪色時(shí)間。脫色液經(jīng)活性碳脫色后，可反復使用。