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PCR擴增產(chǎn)物鑒定與純化實(shí)驗原理及實(shí)驗過(guò)程
更新時(shí)間:2016-05-11 點(diǎn)擊次數:4959

實(shí)驗原理
瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物。(原理參照瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實(shí)驗)

本實(shí)驗使用了TaKaRa公司的膠純化試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit),該試劑盒是從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段的試劑盒。試劑盒采用了*的凝膠融解系統,結合DNA制備膜技術(shù),具有、快速、方便的特點(diǎn),全套操作只需30min便可完成。使用該試劑盒每次可純化得到多至10µg的DNA片段(100bp~30kb),回收率高達50~80%。本試劑盒回收純化的DNA片段純度高,完整性好,可直接用于連接反應、PCR擴增、DNA測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗。

經(jīng)膠純化試劑盒回收的DNA片段采用-20℃低溫保存,延緩DNA的降解。

實(shí)驗試劑
1. PCR擴增產(chǎn)物
2. Agarose Gel DNA Purification Kit (TaKaRa)
3. 瓊脂糖
4. 1×TAE
5. 6×Loading Buffer
6. DNA Marker 2000

實(shí)驗設備
1. 瓊脂糖凝膠電泳系統
2. 紫外透射儀
3. 臺式離心機
4. 移液槍?zhuān)ㄅ涮讟岊^)
5. -20℃低溫冰箱
6. 分析天平

實(shí)驗材料
1. 單面刀片
2. 純化試劑盒
3. 1.5mL離心管
4. 超純水(無(wú)菌)

實(shí)驗步驟
1. 使用1×TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠,然后對目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。(參照瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實(shí)驗)

2. 在紫外燈下切出含有目的DNA(約600bp)的瓊脂糖凝膠,用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時(shí)應注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠,盡量減小凝膠體積,提高DNA回收率。

     注意:切膠時(shí)請注意不要將DNA長(cháng)時(shí)間暴露于紫外燈下,以防止DNA損傷。

3. 切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊融化時(shí)間,提高DNA的回收率。

4. 稱(chēng)量膠塊重量,計算膠塊體積。計算膠塊體積時(shí),以1mg=1µL進(jìn)行計算。

5. 向膠塊中加入膠塊融化液DR-I Buffer,DR-I Buffer的加量如下表:

 

凝膠濃度     DR-I Buffer 使用量  
1%                 3個(gè)凝膠體積量 
1%-1.5%       4個(gè)凝膠體積量 
1.5%-2%       5個(gè)凝膠體積量

 

6. 均勻混合后75℃加熱,融化膠塊(低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠只需在45℃加熱)。此時(shí)應間斷振蕩混合,使膠塊充分融化(約6~10分鐘)。

注意:膠塊一定要充分融化,否則將會(huì )嚴重影響DNA的回收率。

7. 向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer量的1/2體積量的DR-II Buffer,均勻混合。當分離小于400 bp的DNA片段時(shí),應在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。

8. 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

9. 將上述操作7的溶液轉移至Spin Column中,12000 rpm離心1min,棄濾液。

注意:如將濾液再加入Spin Column中離心一次,可以提高DNA的回收率。

10. 將500 µL的Rinse A加入Spin Column中,12000 rpm離心30s,棄濾液。

11. 將700 µL的Rinse B加入Spin Column中,12000 rpm離心30s,棄濾液。

12. 重復操作步驟11。

13. 將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上,在Spin Column膜的中央處加入25 µL的滅菌蒸餾水或Elution Buffer,室溫靜置1min。

注意:使用加熱至60℃的滅菌蒸餾水或Elution Buffer有利于提高洗脫效率。

14. 12000 rpm離心1min洗脫DNA。

-20℃低溫保存純化的目的DNA片段。

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