摘要 : 隨著(zhù)分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的科研人員熟練掌握了分子生物學(xué)的各種試驗技術(shù)，并研制成套試劑盒，使基因克隆表達變得越來(lái)越容易。但分子生物學(xué)的上游工作往往并非是zui終目的，分子克隆與表達的關(guān)鍵是要拿到純的表達產(chǎn)物，以研究其生物學(xué)作用，或者大量生產(chǎn)出可用于疾病治療的生物制品。相對與上游工作來(lái)說(shuō)，分子克隆的下游工作顯得更難，蛋白純化工作非常復雜。

蛋白質(zhì)純化的方法選擇

隨著(zhù)分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的科研人員熟練掌握了分子生物學(xué)的各種試驗技術(shù)，并研制成套試劑盒，使基因克隆表達變得越來(lái)越容易。但分子生物學(xué)的上游工作往往并非是zui終目的，分子克隆與表達的關(guān)鍵是要拿到純的表達產(chǎn)物，以研究其生物學(xué)作用，或者大量生產(chǎn)出可用于疾病治療的生物制品。相對與上游工作來(lái)說(shuō)，分子克隆的下游工作顯得更難，蛋白純化工作非常復雜，除了要保證純度外，蛋白產(chǎn)品還必須保持其生物學(xué)活性。純化工藝必須能夠每次都能產(chǎn)生相同數量和質(zhì)量的蛋白，重復性良好。這就要求應用適應性非常強的方法而不是用能得到純蛋白的方法去純化蛋白。在實(shí)驗室條件下的好方法卻可能在大規模生產(chǎn)應用中失敗，因為后者要求規?；?，且在每日的應用中要有很好的重復性。本文綜述了蛋白質(zhì)純化的基本原則和各種蛋白純化技術(shù)的原理、優(yōu)點(diǎn)及局限性，以期對蛋白純化的方法選擇及整體方案的制定提供一定的指導。

1 蛋白純化的一般原則

蛋白純化要利用不同蛋白間內在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來(lái)除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì )有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來(lái)得到重組蛋白。蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細純化階段二個(gè)階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細胞成分如DNA、RNA等分開(kāi)，由于此時(shí)樣本體積大、成分雜，要求所用的樹(shù)脂高容量、高流速，顆粒大、粒徑分布寬.并可以迅速將蛋白與污染物分開(kāi)，防止目的蛋白被降解。精細純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區分開(kāi)來(lái)，要用更小的樹(shù)脂顆粒以提高分辨純化的*步，它可以初步粗提蛋白質(zhì)，去除非蛋白成分。蛋白質(zhì)在硫酸銨沉淀中較穩定，可以短期在這種狀態(tài)下保存中間產(chǎn)物，當前蛋白質(zhì)純化多采用這種辦法進(jìn)行粗分離翻。在規?；a(chǎn)上硫酸銨沉淀方法仍存在一些問(wèn)題，硫酸銨對不銹鋼器具的腐蝕性很強。其他的鹽如硫酸鈉不存在這種問(wèn)題，但其純化效果不如硫酸銨。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉淀出來(lái)，PEG是一種惰性物質(zhì)，同硫酸銨一樣對蛋白有穩定效果，在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度，蛋白沉淀可通過(guò)離心或過(guò)濾獲得，蛋白可在這種狀態(tài)下長(cháng)期保存而不損壞。 蛋白沉淀對蛋白純化來(lái)說(shuō)并不是多么好的方法，因為它只能達到幾倍的純化效果，而我們在達到目的前需要上千倍的純化。其好處是可以把蛋白從混雜有蛋白酶和其他有害雜質(zhì)的培養基及細胞裂解物中解脫出來(lái)。

2 緩沖液的更換

雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度，但它卻在蛋白純化方案中起著(zhù)極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強度的緩沖液。假如你用硫酸銨將蛋白沉淀出來(lái)，毫無(wú)疑問(wèn)蛋白是處在高鹽環(huán)境中，需要想辦法脫鹽，可用的方法有利用半透膜透析，通過(guò)勤換透析液體去除鹽分，此法尚可，但需幾個(gè)小時(shí)，通常要隔夜，也難以用予大規模純化中。新型的設備將透析膜夾在兩個(gè)板中間，板的一側加緩沖液，另一側加需脫鹽的蛋白溶液，并在蛋白溶液一側通過(guò)泵加壓，可以使兩側溶液在數小時(shí)內達到平衡，若增加對蛋白溶液的壓力，還可迫使水分和鹽更多通過(guò)透析膜進(jìn)入透析液達到對蛋白濃縮的目的。也有出售的脫鹽柱，柱內的填料是小孔徑的顆粒，蛋白分子不能進(jìn)入孔內，先于高濃度鹽離子從柱中流出，從而使二者分離。蛋白純化的每一步都會(huì )造成目的蛋白的丟失，緩沖液平衡的步驟尤甚。蛋白會(huì )結合在任何它能接觸的表面上，剪切力、起泡沫和離子強度的快速變化很容易讓蛋白失活。

3 離子交換色譜

這是在所有的蛋白純化與濃縮方法中zui有效方法?；诘鞍着c離子交換樹(shù)脂間的相互電荷作用，通過(guò)選擇不同的緩沖液，同一種蛋白既可以和陰離子交換樹(shù)脂(能結合帶負電荷的分子)結合，也可以和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結合。樹(shù)脂所用的帶電基團有四種：二乙基氨基乙基用于弱的陰離子交換樹(shù)脂;羧甲基用于弱的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂;季銨用于強陰離子交換樹(shù)脂;甲基磺酸酯用于強陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，氨基酸在不同的pH環(huán)境中所帶總電荷不同。大多數蛋白在生理pH(pH 6—8)下帶負電荷，需用陰離子交換柱純化，的pH下蛋白會(huì )變性失活.應盡量避免。由于在某個(gè)特定的pH下不同的蛋白所帶電荷數不同，與樹(shù)脂的結合力也不同，隨著(zhù)緩沖液中鹽濃度的增加或pH的變化，蛋白按結合力的強弱被依次洗脫 。在工業(yè)化生產(chǎn)中更多地是改變鹽濃度而不是去改變pH值，因為前者更容易控制 。在實(shí)驗室中幾乎總是用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩地上升，當離子強度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來(lái)。但在工業(yè)生產(chǎn)中鹽濃度很難控制，所以常用分步洗脫而不足連續升高的鹽梯度。與排阻層析相比，離子交換特異性更好，有更多的參數可以調整以獲得*的純化效果，樹(shù)脂也比較便宜。值得一提的是，即便是用zui控制的條件，僅用離子交換單一的方法也得不到純的蛋白，還需要其他的純化步驟。

4 親和層析

親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結合而滯留，其他雜蛋白會(huì )流過(guò)柱子。本方法存在的問(wèn)題是：?jiǎn)慰狗浅０嘿F，而且也需先純化;單抗與目的蛋白結合力太強.要用苛刻的條件來(lái)洗脫，這會(huì )使目的蛋白失活并破壞單抗;混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破壞抗體或與它們非特異結合;某些單抗也會(huì )在純化過(guò)程中從樹(shù)脂上解離下來(lái)混入產(chǎn)物中，也需要從終產(chǎn)物中去除。親和柱通常在純化過(guò)程的后期應用，此時(shí)標本體積已縮小，大部分的雜質(zhì)已經(jīng)去除。谷胱甘肽S一轉移酶(Glutathione S—transferase，GST)是

zui常用的親和層析純化標簽之一，帶有此標簽的重組蛋白可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質(zhì)純化，但本方法有以下缺點(diǎn)：首先，蛋白上的GST必須能合適地折疊，形成與谷胱甘肽結合的空間結構才能用此方法純化;其次，GST標簽多達220個(gè)氨基酸，如此大的標簽可能會(huì )影響表達蛋白的可溶性，使形成包涵體，這會(huì )破壞蛋白的天然結構，難于進(jìn)行結構分析，有時(shí)即便純化后再酶切去除GST標簽也不一定能解決問(wèn)題。另一種可應用的親和純化標簽是6組氨酸標簽，組氨酸的咪唑側鏈可親和結合鎳、鋅和鈷等金屬離子，在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標簽的目的蛋白與鎳柱結合，在低pH下用咪唑競爭洗脫。組氨酸標簽與GST相比有許多優(yōu)點(diǎn)，首先，由于只有6個(gè)氨基酸，分子量很小，一般需要酶切去除：其次，可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素和胍中仍能保持結合力;另外6組氨酸標簽無(wú)免疫原性，重組蛋白可直接用來(lái)注射動(dòng)物，也不影響免疫學(xué)分析 。雖然有這么多的優(yōu)點(diǎn)，但此標簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵體、難以溶解、穩定性差及錯誤折疊等。鎳柱純化時(shí)金屬鎳離子容易脫落漏出混入蛋白溶液，不但會(huì )通過(guò)氧化破壞目的蛋白的氨基酸側鏈，而且柱子也會(huì )非特異吸附蛋白質(zhì)，影響純化效果。若目的蛋白可與某種碳水化合物特異結合，或者需要某種特殊的輔因子，可將該碳水化合物或輔因子固相化制成親和柱，結合后目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔因子洗脫。

5 疏水作用層析

疏水作用層析蛋白是由疏水性和親水性氨基酸組成的。疏水性氨基酸位于蛋白空間結構的中心部位，遠離表面的水分子。親水性氨基酸殘基則位于蛋白表面。由于親水性氨基酸吸引了許多的水分子，所以通常情況下整個(gè)蛋白分子被水分子包圍著(zhù)，疏水性氨基酸不會(huì )暴露在外。在高鹽濃度的環(huán)境中蛋白的疏水性區域則會(huì )暴露并與疏水性介質(zhì)表面的疏水性配基結合。不同的蛋白疏水性不同，與疏水作用力大小也不同，通過(guò)逐漸降低緩沖液中鹽濃度沖洗柱子，在鹽濃度很低時(shí)，蛋白恢復自然狀態(tài)，疏水作用力減弱被洗脫出來(lái)。 疏水性樹(shù)脂的選擇性是由疏水性配基的結構決定的，常用的直鏈配體為烷基配體(alkyl ligands)和芳基配體(arylligands)，鏈越長(cháng)結合蛋白的能力也越強。理想樹(shù)脂種類(lèi)的選擇應根據目的蛋白的化學(xué)性質(zhì)而定，不能選擇結合力太強的樹(shù)脂，結合力太強的樹(shù)脂會(huì )很難洗脫，所以開(kāi)始時(shí)應選用中等結合力的苯基樹(shù)脂探討條件。為了使選擇合適的介質(zhì)更容易，Amersham Biosciences推出了疏水作用樹(shù)脂選擇試劑盒，里面包括5種不同的樹(shù)脂供比較。疏水層析很適合作為離子交換純化的下一個(gè)步驟，因為疏水作用層析在高鹽濃度下上樣，從離子交換得到的產(chǎn)物不需更換緩沖液即可使用。蛋白又在低鹽緩沖液中洗脫，又省去了下一步純化前的更換緩沖液的步驟，既節約了時(shí)間，又減少了蛋白的丟失。

6 排阻層析

也叫凝膠過(guò)濾或分子篩。排阻層析柱的填充顆粒是多孔的介質(zhì)，柱中圍繞著(zhù)顆粒所能容納的液體量叫流動(dòng)相，也稱(chēng)無(wú)效體積。太大的蛋白不能進(jìn)入顆粒的孔內，只能存在于無(wú)效體積的溶液中，將會(huì )zui早從柱中洗脫出來(lái)，對這部分蛋白無(wú)純化效果。由于各種蛋白的分子大小不同，擴散進(jìn)入特定大小孔徑顆粒內的能力也各異。大的蛋白分子會(huì )被先洗脫出來(lái)，分子越小，洗脫出來(lái)的越晚。為得到*的純化效果，應將孔徑大小選在目的蛋白能在無(wú)效體積和總柱床體積的中點(diǎn)附近洗脫。排阻層析有其他方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)，首先所能純化的蛋白分子量范圍寬，Tosoh Biosep公司的聚合物樹(shù)脂，排阻極限可達20o000kD;其次，樹(shù)脂微孔的形狀適合分離球形的蛋白質(zhì)，純化過(guò)程中也不需要能引起蛋白變性的有機溶劑。應該注意的是某些蛋白不適合用凝膠過(guò)濾純化，因為本技術(shù)所用樹(shù)脂有輕度的親水性，電荷密度較高的蛋白容易吸附在上面。排阻層析從不用于純化過(guò)程的早期，因為這種方法要求標本高度濃縮，上樣量只能在柱體積的1%--4%之間，柱子要細而長(cháng)才能得到好的分離效果，樹(shù)脂本身也比較昂貴，規?；墓I(yè)生產(chǎn)中不太適用。

7 電泳

丙烯酰胺凝膠電泳通常用來(lái)查看蛋白混合物樣品的復雜程度和監測純化效果。這種方法分離效果*，可惜很難在不喪失精度情況下放大到制備規模，因為隨著(zhù)膠厚度的增加，電泳時(shí)的熱效應會(huì )嚴重干擾蛋白的泳動(dòng)。在基礎研究中，有時(shí)僅需要少量的純蛋白進(jìn)行研究，如蛋白質(zhì)測序等，此時(shí)電泳純化不失為一種簡(jiǎn)便快速的好方法。丙烯酰胺凝膠電泳也是蛋白純化過(guò)程中重要的分析工具，可以檢測目的蛋白是在哪個(gè)梯度的離子交換柱鹽洗脫液中;可用來(lái)判定近年來(lái)隨著(zhù)各學(xué)科的迅猛發(fā)展，對蛋白純化技術(shù)的需求不斷增長(cháng)，已有的純化方法被日益改進(jìn)，新型的純化方法也相繼涌現。羥磷灰石是磷酸鈣的結晶，由于其理化性質(zhì)不夠穩定，結合能力差，很難用于層析。

進(jìn)來(lái)Bio—Rad公司對其進(jìn)行了改進(jìn)，提高了鈣和磷的比例，使形成球形、多孔、性質(zhì)穩定的陶瓷羥磷灰石顆粒，其帶正電的鈣離子和負電性的磷酸根離子可分別與蛋白的羧基及氨基結合。通過(guò)調整緩沖液的pH值，酸性及堿性氨基酸可選擇性地與此樹(shù)脂結合，改變緩沖液的鹽濃度可將蛋白洗脫分離。資料顯示，使用這種方法能使兩種等電點(diǎn)、分子量和疏水性相同的蛋白很好分離。親和純化方面，Sigma發(fā)展了利用FLAG標簽的純化方法，FLA G序列為N—AspTyrLysAspAspAspAsp-Lys-C，分子量小且親水性，與其融合表達的蛋白不易形成包涵體，活性也不受影響，用該公司抗FLA G抗體親和樹(shù)脂即可純化目的蛋白。其他新型標簽及相應純化系統還有CBP fCalmodulin—binding peptide，CBP)、Promega公司的BCCP(Biofin carboxylcarrierprotein.BCCP】標簽和親和素一生物素純化系統、麥芽糖結合蛋白fMaltose-binding protein，MBP)標簽、Biolabs公司的IMPACT—CN系統、Novagen公司的CBD—Tag和，I7一Tag 系統等。相信隨著(zhù)時(shí)間的推移，會(huì )有更多更好的方法出現，合理充分地應用這些方法，對科研、生物制藥、疫苗、診斷試劑研制等工作都會(huì )有很大幫助。