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上海嘉鵬解析熒光定量PCR常用術(shù)語(yǔ)
更新時(shí)間:2016-04-01 點(diǎn)擊次數:1523

基線(xiàn):基線(xiàn)是早期循環(huán)的噪點(diǎn)水平,通常在第3和第15循環(huán)之間測量,這是因為在此期間還檢測不到擴增產(chǎn)物引起的熒光值增加。用于計算基線(xiàn)的循環(huán)數量是可以改變的,如果使用高模板量或者靶標基因的表達水平高則循環(huán)數量需要減少。設置基線(xiàn)需要查看線(xiàn)性度擴增曲線(xiàn)的熒光數據。設置基線(xiàn),使得擴增曲線(xiàn)的增長(cháng)所開(kāi)始的循環(huán)圈數大于基線(xiàn)循環(huán)zui高圈數。對每個(gè)靶標序列都需要單獨設置基線(xiàn)。早期循環(huán)檢測到的平均熒光值需要從擴增產(chǎn)物中獲得的熒光值中減去。各種real-timePCR軟件的版本允許單個(gè)樣品自動(dòng)優(yōu)化基線(xiàn)設置。
本底:是指反應中的非特異性熒光值,例如,低效率的熒光淬滅,或由于使用SYBR Green造成的大量雙鏈DNA模板。信號的本底分量由real-time PCR軟件算法數學(xué)除去。
報告基因信號 :在real-time PCR過(guò)程中由SYBR Green或熒光標記的序列特異性探針產(chǎn)生的熒光信號。
歸一化報告信號(RN):這是報告染料熒光強度除以在每個(gè)循環(huán)中測量的被動(dòng)參照染料的熒光強度。
被動(dòng)參比染料 :在某些real-time PCR中,熒光染料ROX被用作熒光信號標準化內部參照。它可以逐孔校正因校正因移液不準確、孔位置及熒光波動(dòng)造成的變動(dòng)。
閾值:閾值調整到本底值之上并顯著(zhù)低于擴增曲線(xiàn)的平穩值。它必須處于擴增曲線(xiàn)的線(xiàn)性區域內,代表了PCR檢出的對數線(xiàn)性范圍。閾值應在對數擴增曲線(xiàn)視圖中進(jìn)行設置,以使PCR的對數線(xiàn)性期易于識別。如果real-time PCR中有多個(gè)目標基因,閾值必須為每個(gè)目標進(jìn)行設定。
循環(huán)閾值(CT)或交叉點(diǎn)(CP):擴增曲線(xiàn)穿過(guò)閾值的循環(huán)(即,熒光檢測值顯著(zhù)增加的點(diǎn))。CT可以是一個(gè)分數,并且可以計算起始模板量。
ΔCT值: ΔCT值描述了靶標基因和相應的內參基因CT值的差值,例如看家基因,并用于標準化模板的使用量:
ΔCT = CT (靶標基因) – CT (內源性參比基因)
ΔΔCT值:ΔΔCT值描述了感興趣樣品(例如,刺激細胞)的平均ΔΔCT值與參考樣本(例如,未刺激細胞)的平均ΔΔCT值之間的差值。參照樣品也被稱(chēng)為校準樣品,并且所有其它樣品進(jìn)行相對定量時(shí)都將被標準化到如此:
ΔΔCT = 平均ΔCT (感興趣樣品) – 平均ΔCT (參比樣本)
內源性參比基因:e這種基因的表達水平在樣品間不存在差異,例如看家基因(3)。對比內參基因與靶標基因的CT值可以將靶標基因的表達水平歸一化到輸入的RNA或cDNA的量(見(jiàn)上面關(guān)于ΔCT值部分)。反應中模板的確切數量不確定。內參基因對以下情況作出校正:可能的RNA降解或RNA樣品中存在酶抑制劑的情況,以及RNA含量、逆轉錄效率、核酸回收和樣品處理的變動(dòng)。為了選出*的參照基因(多個(gè)),我們對算法進(jìn)行了改進(jìn),允許其選擇依賴(lài)于實(shí)驗設置*參照(4)。
內參:在同一反應中被作為靶序列擴增的,并用不同的探針(即,進(jìn)行雙重PCR)檢測的對照序列。內參經(jīng)常被用來(lái)排除失敗的擴增,例如沒(méi)有檢測到目標序列的情況。
標定樣品:在相對定量中使用的參比樣品(例如,源自細胞株或組織純化的RNA),用以與所有其他樣品進(jìn)行比較,以確定某一基因的相對表達水平。標定樣品可以是任何樣品,但通常是一個(gè)對照品(例如,未處理的樣品或來(lái)自實(shí)驗零時(shí)的樣品)。
陽(yáng)性對照:使用已知量模板的對照反應。陽(yáng)性對照通常用來(lái)檢查引物集或引物–探針集工作是否正常,以及反應是否正確設置。
無(wú)模板對照(NTC):包含除模板之外的所有擴增反應所必要組分的對照反應。這使得發(fā)現由于污染的試劑或外源DNA造成的污染成為可能,例如從以前的PCR中。
無(wú)RT對照: RNA制備物可能含有殘留的基因組DNA,如果檢測不被設計為僅檢測和擴增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中進(jìn)行檢測。DNA污染可以通過(guò)操作在其中沒(méi)有加入逆轉錄酶的RT對照反應來(lái)進(jìn)行檢測。
標準品:已知濃度或拷貝數,用于構建標準曲線(xiàn)的樣品。
標準曲線(xiàn):要生成標準曲線(xiàn),CT值/不同標準稀釋的交叉點(diǎn)對標準物質(zhì)輸入量的對數繪圖。標準曲線(xiàn)通常是使用至少5種不同濃度的標準稀釋倍比生成。每個(gè)標準曲線(xiàn),應檢查其有效性,斜率值落在–3.3到–3.8之間。標準是各濃度一式三份的理想測定值。標準曲線(xiàn)的斜率如果與這些值差異較大則應該舍棄。
效率和斜率:標準曲線(xiàn)的斜率提供了對real-time PCR的效率指示。斜率–3.322表示該PCR具有數值為1的效率,或100%的效率,并且PCR產(chǎn)物的量在每個(gè)循環(huán)增加到兩倍。效率小于–3.322(例如,–3.8)則表示PCR的效率<1。通常,大多數擴增反應因為實(shí)驗的限制不能達到100%的效率。斜率大于–3.322(例如,–3.0)表明PCR效率似乎是大于100%的。當在反應中的非線(xiàn)性期對值進(jìn)行測量時(shí)可能發(fā)生這種情況,或者它可以指示是否有抑制劑存在。

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