首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(即錯配) ，再次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發(fā)夾結構。引物設計應注意如下要點(diǎn)：
1.引物的長(cháng)度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp。
2.引物序列在模板內應當沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3 個(gè)以上的連續堿基，如GGG 或CCC，也會(huì )使錯誤引發(fā)機率增加。
3.引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。
4.引物序列的GC 含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5.引物的另一個(gè)重要參數是熔解溫度(Tm)。這是當50%的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。合理的退火溫度從55℃到70℃。為獲得*結果，兩個(gè)引物應具有近似的Tm值。
6.引物二聚體或發(fā)夾結構也可能導致PCR 反應失敗。應該盡量避免。