基因組DNA提取純化的注意事項
更新時(shí)間:2015-07-01 點(diǎn)擊次數:1077
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大多數動(dòng)物組織可以用裂解緩沖液和蛋白酶/蛋白酶 K 進(jìn)行裂解。在加入裂解液之前需要將組織切成小塊,有條件的話(huà)建議使用 TissueLyser 或研缽等提前進(jìn)行均質(zhì)化。骨骼肌,心臟,皮膚等組織含有收縮蛋白,結締組織和膠原蛋白,所以利用蛋白酶 / 蛋白酶 K 進(jìn)行充分消化是必須的。 FFPE 樣本進(jìn)行 DNA 純化時(shí)需要預裂解。福爾馬林可由 PBS 洗滌除去,石蠟可由二甲苯和乙醇進(jìn)行去除。在蛋白酶消化后提高孵育的溫度有助于逆轉交聯(lián),以便更好的從 FFPE 組織中釋放 DNA,從而有助于提高 DNA 產(chǎn)量和改善下游檢測性能。 從 FFPE 中得到的 DNA 通常比從新鮮或凍存樣本中得到的 DNA 分子量??;DNA 降解的程度則取決于樣本類(lèi)型,儲存時(shí)間和固定的條件。 |
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微量樣本中 DNA 的含量很低,通常小于 5 ng DNA, 通常需要使用 carrier RNA 來(lái)提高產(chǎn)量(不會(huì )影響下游分析檢測)。如果需要使用 carrier RNA,那么在測量 OD 的時(shí)候會(huì )因為使用 carrier RNA 造成濃度測量有偏差(因為 RNA 在 260 nm 也有吸收)。 推薦使用 QIAamp DNA Micro Kit 從微量樣本中進(jìn)行 DNA 純化,該試劑盒采用 MinElute 硅膠膜柱,洗脫體積可以低至 20 μl,同時(shí)通過(guò)兩步洗滌去除 PCR 抑制劑等污染物,zui大程度從微量樣本中純化 DNA。 |
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血液樣本可以是新鮮或凍存全血或干血片,由于血液樣本在采集后會(huì )迅速凝固,所以通常在采血時(shí)使用 EDTA,檸檬酸鹽或肝素進(jìn)行抗凝。經(jīng)過(guò)抗凝處理的血液樣本可以直接用于 DNA 純化,需要注意的是使用的 DNA 純化方法需要能夠去除上述抗凝劑,以免干擾下游 PCR 檢測。全血也可以在 DNA 純化前*行白細胞富集等再進(jìn)行 DNA 純化。 從血液中純化 DNA 的產(chǎn)量很大程度上取決于血液中的白細胞數量,而白細胞數量則和血液的供體情況有很大關(guān)聯(lián)(如貧血或感染都會(huì )造成白細胞數量變化)。上述情況必須在進(jìn)行 DNA 純化前就應該考慮到。此外,有些動(dòng)物有有核血,這意味著(zhù)這類(lèi)樣本中含有更多的 DNA,在從此類(lèi)血樣中純化 DNA,上樣量需要減少 10 倍左右。 |
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- 哺乳動(dòng)物細胞可以使用蛋白酶 K 進(jìn)行裂解
- 酵母細胞需要首先使用溶菌酶對細胞壁進(jìn)行處理,然后使用蛋白酶或蛋白酶 K 進(jìn)行消化
- 許多細菌細胞可以使用裂解 buffer 和蛋白酶 / 蛋白酶 K 進(jìn)行裂解,某些細菌如革蘭氏陽(yáng)性菌需要預先使用溶菌酶對細胞壁進(jìn)行處理
- 細菌細胞需要先從生物體液中沉淀,然后從中純化細菌 DNA,拭子樣本需要先使用殺菌劑進(jìn)行預處理然后再離心
- 使用機械裂解會(huì )比用酶消化的效果要好,尤其是針對革蘭氏陽(yáng)性菌或真菌而言
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