實(shí)驗原理

帶電荷的蛋白質(zhì)，在電場(chǎng)中向著(zhù)與其所帶電荷電性相反的電極泳動(dòng)稱(chēng)為電泳。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，但大都在pH7以下，若將血清置于pH8.6的緩沖液中，則這些蛋白質(zhì)均帶負電，在電場(chǎng)中都向陽(yáng)極移動(dòng)。由于各種蛋白質(zhì)在同一pH環(huán)境中所帶負電荷多少及分子大小不同，所以在電場(chǎng)中向陽(yáng)極泳動(dòng)速度也不同。蛋白質(zhì)分子小而帶電荷多者，泳動(dòng)速度快;反之，則泳動(dòng)速度慢。因此可將血清蛋白質(zhì)依次分為清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五條區帶，經(jīng)染色可計算出各血清蛋白質(zhì)含量的百分數。

以醋酸纖維薄膜(CAM)為支持介質(zhì)，電泳分離后經(jīng)染色處理，可展示出清晰的蛋白質(zhì)電泳圖譜。由于染色時(shí)染料與蛋白質(zhì)的結合與蛋白質(zhì)的量成正比，因此將各蛋白質(zhì)帶剪下，分別用一定量的NaOH稀溶液洗脫下來(lái)，即可進(jìn)行比色，測定出各蛋白質(zhì)區帶的相對含量。也可用一定量的有機溶劑使CAM溶解制成透明膜而用光密度計進(jìn)行掃描定量。

醋酸纖維薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便及分辨率較高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應用于血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、同工酶的分離和測定。

實(shí)驗試劑

1.巴比妥—巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，m=0.06)。稱(chēng)取巴比妥2.21克和巴比妥鈉12.36克，溶于500毫升蒸餾水中，加熱溶解。待冷至室溫后，再加蒸餾水稀釋至1000毫升。

2.染色液

(1)麗春紅S染色液：稱(chēng)取麗春紅S O.4g、三氯醋酸6g，用蒸溜水溶解并稀釋至100ml。

(2)氨基黑10B染色液：稱(chēng)取氨基黑(C22H13O12N6S3Na3)10B 0.1g,溶于20ml無(wú)水乙醇中，加冰醋酸5ml,使其溶解。另取磺基水楊酸2.5g，溶于少量的蒸餾水中，加入前液將兩液混合搖勻，再以蒸餾水補足至100ml。稱(chēng)取麗春紅S0.4克及三氯醋酸6克;用蒸餾水溶解，并稀釋至100毫升。

3.漂洗液。

(1)3%(V/V)醋酸溶液：適用于麗春紅S染色的漂洗。

(2)甲醇45ml、冰醋酸5ml、蒸餾水50ml混勻，適用于氨基黑10B染色的漂洗。

4.透明液 取無(wú)水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混勻備用。

5. 洗脫液

(1)0.1mol/L NaOH溶液：用于麗春紅S染色的洗脫。

(2)0.4mol/L NaOH溶液：用于氨基黑10B染色的洗脫。

6.40%(V/V)醋酸溶液。

實(shí)驗設備 電泳儀、電泳槽、分光光度計或光密度儀。

實(shí)驗材料 醋酸纖維薄膜、培養皿、濾紙、鑷子、點(diǎn)樣器、直尺、鉛筆、剪刀等。

實(shí)驗步驟

1、電泳槽的準備

將巴比妥-巴比妥鈉緩沖液加入電泳槽中(兩側槽內注入等量的緩沖液)，調節兩側內的緩沖液，使其在同一水平面，液面與支架的距離約為2～2.5cm。支架寬度到恰好適合CAM的長(cháng)度，用3～4層濾紙或4層紗布搭橋。

2、CAM準備

取醋纖薄膜(2厘米*8厘米)在CAM的無(wú)光澤面(涂有醋酸纖維素)距一端1.5cm處用直尺和鉛筆輕劃一線(xiàn)(與CAM的長(cháng)軸垂直)，作點(diǎn)樣標記，將膜條編號后將無(wú)光澤面朝下浸入巴比妥-巴比妥鈉緩沖液中，待充分浸透后取出(一般約需求20～30min)，夾于潔凈的濾紙中,吸去多余的緩沖液.

3、點(diǎn)樣

用血清加樣器將3-5ul無(wú)溶血的新鮮血清均勻地點(diǎn)在劃線(xiàn)處，樣品應與膜的邊緣保持一定距離，以免電泳圖譜中的蛋白區帶變形。待血清滲入膜后移開(kāi)點(diǎn)樣器。點(diǎn)樣應注意，要適量、均勻和垂直，并避免弄破薄膜。

4、平衡

將已點(diǎn)樣的薄膜加樣面朝下，點(diǎn)樣端置于陰，將膜條緊貼于電泳槽支架的鹽橋上并保持平直，橋的另一端垂入緩沖液中，鹽橋將膜的兩端與緩沖液連通，加上槽蓋平衡5min后通電電泳。

5、電泳

正確聯(lián)接電泳槽與整流器對應的正負極，點(diǎn)樣側接負極，另一側接正極。開(kāi)啟電源通電。調節電壓10V～15V/cm膜長(cháng),電流0.4～0.6mA/cm膜總寬，電泳40-60分鐘(通常夏季需45min,冬季需60min)，待電泳區帶展開(kāi)3.5cm～4cm時(shí)即可關(guān)閉電源。

6、染色

通電完畢，立即取出薄膜直接浸入麗春紅S或氨基黑10B染色液中，染色5～10分鐘。

7、漂洗

至少準備3～4個(gè)漂洗皿，裝入漂洗液。從染色液中取出薄膜條并盡量瀝去染色液，按順序投入漂洗液中反復漂洗，直至背景漂白為止。此時(shí)清晰可見(jiàn)5條色帶。待干。

8、定量

(1)洗脫比色法 取六支試管，分別標明“A、α1、α2、β、γ、空白"。將漂洗凈的薄膜剪下各區帶放入相應的試管內，另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白管中，根據染色不同按以下方法洗脫。

①氨基黑10B染色洗脫：6支試管于清蛋白管內加入0.4mmol/L NaOH溶液6ml,其余5管各加3ml，振搖數次，置37℃水浴20分鐘，使色澤*浸出。用620nm波長(cháng)，以空白管調零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。

②麗春紅S染色洗脫：洗脫液用0.1mmol/L氫氧化鈉溶液，加入量同上。10分鐘后，于清蛋白管內加入40%(V/V)醋酸0.6ml，其余5管各加入0.3ml，以中和部分氫氧化鈉，使溶液色澤加深。如出現沉淀，可離心取上清液比色。用520nm波長(cháng)，以空白管調零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。

(2)光密度掃描法

① 透明：將已漂凈吹干的CAM條浸入透明液中3～5分鐘，取出平鋪于潔凈干燥玻片上(應無(wú)氣泡)，直立片刻除去過(guò)多的透明液。于90～100℃烘箱內烘烤5～10分鐘，取出冷卻至室溫。此法透明的CAM，各蛋白區帶鮮明，薄膜平整，可直接掃描或作*保存。若用十萘氫或液體石醋透明，應將漂洗過(guò)的薄膜烘干后進(jìn)行透明，透吸后的薄膜不能久藏，易發(fā)生皺折。

② 掃描定量：將已透明的薄膜放入全自動(dòng)光密度計或其它光密度掃描的光路，選擇波長(cháng)520nm，描記各蛋白區帶峰，并計算各蛋白成分的相對含量。

9、計算

定量計算時(shí)，先計算各光密度值的總和：再計算血清各部分蛋白質(zhì)所占的百分率

吸光度總和(T)=2A+α1+α2+β+γ(吸光度)

血清各蛋白組分的相對百分數=Ax/AT×100%

Ax表示各球蛋白組分 (2A+α1+α2+β+γ)的吸光度。

A%=2A/ T×100% β=β/ T×100%

α1%=α1/ T×100% γ%=γ/ T×100% α2%=α2/ T×100%

各組分蛋白質(zhì)含量(g/L)=(各組分蛋白百分數(%)×血清總蛋白g/L)/100

10、臨床意義

(1)血清蛋白醋纖薄膜電泳的正常參考值為：

蛋白質(zhì)組分 g/L 占總蛋白百分比(%)

白蛋白 35～52 57.0～68.0

α1球蛋白 1.0～4.0 1.0～5.7

α2球蛋白 4.0～8.0 4.9～11.2

β球蛋白 5.0～10.0 7.0～13.0

γ球蛋白 6.0～13.0 9.8～18.2

(2)臨床意義

電泳圖譜可為臨床疾病診斷提供依據。

腎病型可見(jiàn)于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭等，圖型表現為Alb降低，α2和β升高;肝硬化型可見(jiàn)于慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬變等，圖型表現為Alb降低，β和γ增高，可出現β與γ難以分離而連接在一起的“β-γ"橋，此現象是由于肝臟纖維增生導致IgA增高所致;急性反應時(shí)相型常以α1、α2增高為特征;慢性炎癥型則以Alb降低，α2、γ增高較為常見(jiàn);M蛋白血癥主要見(jiàn)于多發(fā)性骨髓瘤，病人有大量單克隆蛋白質(zhì)(主要是IgG或IgA)，電泳時(shí)可在β和βγ之間出現一條峰形狹窄的區帶，稱(chēng)M區帶。

注意事項

1.通電時(shí)，不得接觸槽內的緩沖液或CAM，以防觸電。

2.每次電泳時(shí)應交換電極以使兩側電泳槽內緩沖液的正負離子相互交換，以使緩沖液的PH維持在一定水平。

3.電泳緩沖液的液面要保持一定的高度，過(guò)低可能會(huì )出現γ球蛋白的電滲現象(γ球蛋白向陰極移動(dòng))，同時(shí)電泳槽兩側的液面應保持在同一水平，否則，通過(guò)薄膜時(shí)有虹吸現象，將會(huì )影響蛋白質(zhì)分子的泳動(dòng)速度。

4.電泳失敗或圖譜不理想的常見(jiàn)原因

(1)電泳圖譜不整齊或蛋白各組分分不佳：點(diǎn)樣過(guò)多;點(diǎn)樣不均勻、不整齊;薄膜過(guò)濕，樣品擴散;點(diǎn)樣速度太慢，薄膜表面局部干燥或薄膜未*浸透或溫度過(guò)高致使膜面局部干燥或水分蒸發(fā);緩沖液變質(zhì);電泳時(shí)薄膜放置不正，歪斜、彎曲，與電流方向不平行;樣品不新鮮;電流過(guò)低;CAM質(zhì)量不好，薄膜結構過(guò)分細密，透水性差，導電差等。

(2)染色后白蛋白中間著(zhù)色淺：染色時(shí)間不夠或染色液陳舊;白蛋白含量過(guò)高，可減少血清用量或延長(cháng)染色時(shí)間。

(3)電泳速度慢：電流過(guò)低;供給薄膜的緩沖液不足，連接薄膜與緩沖液的濾紙或紗布過(guò)薄;溫度過(guò)低;薄膜結構過(guò)分細密，透水性差，導電差;緩沖液水分蒸發(fā)，致使離子強度增大。

(4)薄膜透明不*：透明液陳舊;浸泡時(shí)間不足;烘箱溫度未到90℃即把薄膜放入。

5.染料問(wèn)題：各種染料對血清各組分有不同的親和力，大多數染料對白蛋白的親和力大于球蛋白。如氨基黑10B對球蛋白的結合力為白蛋白的80%，因此常導致白蛋白結果偏高，球蛋白偏低。用麗春紅S染色，效果優(yōu)于氨基黑10B。麗紅是一種指示劑，PH<10時(shí)呈紅色，PH>12.5時(shí)呈紫色。在酸性溶液中它的zui大吸收峰在523nm左右，呈對稱(chēng)性。在血清蛋白正常濃度范圍內，麗春紅S能與各蛋白質(zhì)組分成正比例結合，而氨基黑10B則對白蛋白染色過(guò)深，區帶中容易出現著(zhù)色不全的小點(diǎn)，不夠理想。

6.樣品要求點(diǎn)在粗糙面(無(wú)光澤面)，否則樣品很難吸入膜內。電泳時(shí)將點(diǎn)有樣品的一面朝下，以防電泳過(guò)程中水分蒸發(fā)，影響電泳結果。

7.標本應新鮮，不得溶血。溶血標本會(huì )使β球蛋白假性升高，因血紅蛋白電泳位置在β球蛋白區域內。