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PCR檢測的質(zhì)量控制
更新時(shí)間:2015-05-26 點(diǎn)擊次數:929

一、試驗儀器 
PCR儀和紫外凝膠成像系統(紫外分析儀或手提紫外等)以及移液器都可能影響PCR檢測的質(zhì)量。PCR儀是控制PCR反應溫度變化的,其溫度和控制時(shí)間的準確程度可能會(huì )影性PCR檢測質(zhì)量。移液器取液的準確程度影響反應體系是否能達到*反應環(huán)境。紫外分析系統對檢測敏感性有明顯的影響。紫外分析系統有3種類(lèi)型儀器:紫外分析儀、紫外凝膠成像系統、手提紫外燈。紫外分析儀直接用眼睛觀(guān)察瓊脂糖凝膠上DNA擴增帶。紫外凝膠成像系統是在計算機上通過(guò)攝像系統對瓊脂糖凝膠上DNA擴增帶進(jìn)行觀(guān)察。手提紫外燈可以在電泳過(guò)程中直接對瓊脂糖凝膠上DNA擴增帶進(jìn)行觀(guān)察,使用方便,分辨率比較低。依據這些儀器的分辨率由高到低順序是紫外分析儀、紫外凝膠成像系統、手提紫外燈。紫外分析儀有時(shí)能看到弱陽(yáng)性擴增帶,在紫外凝膠成像系統上卻看不到。手提紫外燈只有在陽(yáng)性擴增帶比較亮時(shí)才能看到,建議為保證檢測質(zhì)量不用手提紫外燈,可用于臨時(shí)的電泳結果觀(guān)察。 
儀器的質(zhì)量控制應該通過(guò)實(shí)驗室質(zhì)量認證來(lái)實(shí)施,定期進(jìn)行儀器的效驗。沒(méi)有質(zhì)量認證的實(shí)驗室可以定期請儀器生產(chǎn)廠(chǎng)家進(jìn)行效驗和保養,確保所有儀器處于正常的工作狀態(tài)。 

二、試驗試劑與耗材 
在PCR檢測質(zhì)量控制中,試劑的選擇具有十分重要的作用,也是實(shí)驗人員zui為關(guān)注的檢測質(zhì)量控制因素。試劑一定選擇質(zhì)量和信譽(yù)好的廠(chǎng)商,一但選定后不要輕易改換。如果必須改換時(shí)應與原產(chǎn)品進(jìn)行嚴格比對試驗,包括敏感性、特異性、試劑保存期等試驗。并且經(jīng)常要注意不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的差異。比如說(shuō)TaqDNA聚合酶,不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的質(zhì)量是有差異的,盡管都是標出相同活性單位,但其標定方法和保存液的成分以及運輸過(guò)程的不同常常導致實(shí)際活性單位是有差異的,有時(shí)由于其活性低,使得弱陽(yáng)性樣品漏檢;有時(shí)由于其活性過(guò)高出現非特異擴增。這與ELISA檢測中酶結合物的作用相似。其實(shí)影響PCR檢測結果的試劑很多,可以這樣說(shuō),PCR檢測用的所有試劑都可能影響檢測效果??刂圃噭┑馁|(zhì)量是作好PCR檢測前提。我們認為:是選擇PCR試劑盒來(lái)控制試劑質(zhì)量。 
評價(jià)一種PCR試劑盒,除了考慮它的敏感性、特異性、穩定性、操作簡(jiǎn)便程度外,還應包括:試劑盒提供的試劑覆蓋整個(gè)PCR檢測試驗的程度。如果試劑盒提供了整個(gè)PCR檢測試驗的試劑,表明該試劑盒對PCR檢測試驗的試劑具有了全程控制性能。相反,PCR檢測的試劑的質(zhì)量控制程度比較低,意味著(zhù)檢測質(zhì)量可控程度低。例如:溴化乙錠僅僅起熒光染料的作用,如果在陽(yáng)光下長(cháng)時(shí)間的照射下失效了,在紫外燈下發(fā)熒光效能降低,可能會(huì )造成一些弱陽(yáng)性樣品的漏檢,出現假陰性。其它試劑出現問(wèn)題也是一樣影響檢測質(zhì)量。試劑盒在生產(chǎn)過(guò)程中,有一套試劑生產(chǎn)質(zhì)量控制體系。每一試劑組分都經(jīng)過(guò)靈敏度、敏感性、特異性質(zhì)量控制的檢測,在有效期內能確保每種試劑的質(zhì)量。因此,選擇試劑盒進(jìn)行PCR檢測是比較理想的控制方法。在PCR檢測中,全部使用試劑盒提供試劑,對PCR檢測質(zhì)量控制有益。 
實(shí)驗耗材也是影響PCR檢測質(zhì)量的因素之一。PCR反應管薄厚以及傳導熱量性能等直接影響PCR檢測效果。在熱蓋PCR儀上一般不需要加入礦物油,但有些PCR反應管蓋子不嚴密,導致擴增過(guò)程中反應液水份蒸發(fā),嚴重影響檢測靈敏度。PCR反應體系是微量的,移液器的Tip頭生產(chǎn)質(zhì)量不好時(shí),有時(shí)致使液體殘留量多或洪吸作用強,導致試劑盒中試劑量不夠,配置PCR反應體系不準,造成檢測質(zhì)量下降。 
在每次PCR檢測時(shí),一定設立陰性對照樣品和陽(yáng)性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時(shí),表明試驗全部過(guò)程的試劑沒(méi)有受到污染;陽(yáng)性對照樣品檢測為陽(yáng)性時(shí),表明DNA提?。≧NA提取、RNA反轉錄)、DNA擴增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽(yáng)性對照樣品檢測結果成立的前提下,才能對檢測樣品進(jìn)行判定。因此,每次試驗都應設立表明DNA提?。≧NA提取、RNA反轉錄)、DNA擴增和電泳鑒定對照,只有設立試驗全程的對照,才能證明試驗結果成立。這一點(diǎn)對PCR和RT-PCR檢測試驗是非常重要的。 
陽(yáng)性對照在試劑盒中是必須有的組分。設立陽(yáng)性對照有3種類(lèi)型:*種是用檢測的病原微生物作為陽(yáng)性對照。這樣的直接對照優(yōu)點(diǎn)是直觀(guān)、準確、本次試驗完整條件對照,可以說(shuō)明此次試驗是否成立。缺點(diǎn)是對檢測過(guò)程中增加了PCR污染的指數。另外,不能表明每個(gè)檢測樣品對照成立。第二種是設立一種與檢測病毒無(wú)關(guān)微生物作為陽(yáng)性對照。優(yōu)點(diǎn)是降低了PCR污染的危險性,并且提高了試劑盒的生物安全性。缺點(diǎn)是僅是參考陽(yáng)性對照,不夠直接、*反映本次試驗成立,也不能表明每個(gè)檢測樣品對照成立??蛇m合怕污染的實(shí)驗室或要求生物安全等級高的病原微生物的檢測。第三種是在每個(gè)反應管內設立參考對照,除了陽(yáng)性擴增帶之外,又設立一條擴增帶,指示每個(gè)反應管內檢測情況。檢測為陽(yáng)性時(shí)出現兩條不同大小擴增帶,陰性時(shí)出現一條擴增帶。這種對照設立技術(shù)要求高,成本也高些,對照效果是的,可以排除每個(gè)檢測樣品操作失誤或試劑出現問(wèn)題對檢測造成的影響。由于在一個(gè)反應管內對兩條模板同時(shí)進(jìn)行擴增,相互之間多少有一定的干擾,因此,對病原微生物檢測靈敏度或多或少有一定影響。此種對照方式可能會(huì )成為PCR對照的發(fā)展趨勢。 

三、人員操作 
我們多名實(shí)驗室人員曾經(jīng)對相同樣品同時(shí)進(jìn)行檢測,檢測結果確實(shí)存在差異。經(jīng)常檢測人員比其他實(shí)驗人員檢測的靈敏度高10~100倍。說(shuō)明PCR檢測的試驗確實(shí)有一定的操作技術(shù)需要熟悉和訓練,不同的人員對檢測結果有一定的影響。加強人員的操作技能的訓練是必須的,需要實(shí)驗技術(shù)人員對PCR檢測有一個(gè)熟練的過(guò)程。 
PCR污染控制是PCR檢測操作人員必須非常注意一項內容。實(shí)驗室設置上分配液區、模板提取區、擴增區、電泳區。物流應按分配液區、模板提取區、擴增區、電泳區順序,嚴禁倒流。人員操作也應非常注意,比如注意經(jīng)常打掃衛生消毒、對移液器要定期進(jìn)行清洗、消毒。及時(shí)試驗操作簡(jiǎn)便、快速、準確等。 

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