免疫熒光技術(shù)基本原理
免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎上建立起來(lái)的一項技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結合，利用抗原抗體反應進(jìn)行組織或細胞內抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年采用熒光素進(jìn)行標記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱(chēng)為熒光抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）。
用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱(chēng)熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱(chēng)熒光抗原法。這兩種方法總稱(chēng)免疫熒光技術(shù)，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結合，用于檢測或定位抗體，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應用，所以人們習慣稱(chēng)為熒光抗體技術(shù)，或稱(chēng)為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱(chēng)為免疫熒光細胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。

該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問(wèn)題尚未完*，結果判定的客觀(guān)性不足，技術(shù)程序也還比較復雜。
熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無(wú)放射性污染，并且大多操作簡(jiǎn)便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬于此類(lèi)，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。
由于一般熒光測定中的本底較高等問(wèn)題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。近年來(lái)發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應用。

1．原理　
免疫學(xué)的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。
直接法：將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。
間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（*抗體）與抗原標本進(jìn)行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗原—抗體—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為*抗體，其它步驟的抗原檢查相同。
標記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應，因此，制備標記抗體適用于雞任何抗原的診斷。

2．技術(shù)分類(lèi)：
⑴ 熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù))
抗原抗體反應后，利用熒光顯微鏡判定結果的檢測方法。

⑵ 免疫熒光測定技術(shù)：
抗原抗體反應后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法-
（1）熒光物質(zhì)
1）熒光色素
許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱(chēng)為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：
(1)異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，zui大吸收光波長(cháng)為490495nm，zui大發(fā)射光波長(cháng)520530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：
有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質(zhì)結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用zui廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。
(2)四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩定，可長(cháng)期保存。結構式如下：
zui大吸收光波長(cháng)為570nm，zui大發(fā)射光波長(cháng)為595～600nm，呈橘紅色熒光。
(3)四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結構式如下：
zui大吸引光波長(cháng)為550nm，zui大發(fā)射光波長(cháng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結合，但熒光效率較低。

（2）其他熒光物質(zhì)
1）酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(cháng)為360nm，發(fā)射光波長(cháng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。
2）鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應用zui廣。
螯合物的激發(fā)光波長(cháng)范圍寬，發(fā)射光波長(cháng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(cháng)，用于分辨熒光免疫測定。" j/ I" J: F; N

（3）常見(jiàn)熒光素：
1）FITC
2）RB200
3）TRITC2
4）鑭系：Eu、Tb
5）PE
6）其它
常見(jiàn)熒光素的特性：
1）FITC：黃色結晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。
2）RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光 595~600nm，橘紅色熒光。
3）TRITC： 紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光 620nm，橙紅色熒光。
4）鑭系：Eu、Tb
5）PE：吸收光490~560nm，發(fā)射光 595nm，紅色熒光。
6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。
酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)：
酶 底物 產(chǎn)物 激發(fā)光 發(fā)射光
MUG MU 360 450
MUP MU 360 450
HRP HPA 二聚體 317 414

（4）合適熒光素的選擇
1）具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團。
2）熒光效率高，標記后下降不明顯。
3）熒光色澤與背景色澤對比鮮明。
4）標記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性
5）標記方法簡(jiǎn)單、快速。
6）安全無(wú)毒