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電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團,它們在某個(gè)特定的pH值下可以帶正電或負電,在電場(chǎng)的作用下,這些帶電分子會(huì )向著(zhù)與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下,由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。
電泳過(guò)程必須在一種支持介質(zhì)中進(jìn)行。Tiselius等在1937年進(jìn)行的自由界面電泳沒(méi)有固定支持介質(zhì),所以擴散和對流都比較強,影響分離效果。于是出現了固定支持介質(zhì)的電泳,樣品在固定的介質(zhì)中進(jìn)行電泳過(guò)程,減少了擴散和對流等干擾作用。zui初的支持介質(zhì)是濾紙和醋酸纖維素膜,目前這些介質(zhì)在實(shí)驗室已經(jīng)應用得較少。在很長(cháng)一段時(shí)間里,小分子物質(zhì)如氨基酸、多肽、糖等通常用濾紙或纖維素、硅膠薄層平板為介質(zhì)的電泳進(jìn)行分離、分析,但目前則一般使用更靈敏的技術(shù)如HPLC等來(lái)進(jìn)行分析。這些介質(zhì)適合于分離小分子物質(zhì),操作簡(jiǎn)單、方便。但對于復雜的生物大分子則分離效果較差。凝膠作為支持介質(zhì)的引入大大促進(jìn)了電泳技術(shù)的發(fā)展,使電泳技術(shù)成為分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的重要手段之一。zui初使用的凝膠是淀粉凝膠,但目前使用得zui多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質(zhì)電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。
電泳裝置主要包括兩個(gè)部分:電源和電泳槽。電源提供直流電,在電泳槽中產(chǎn)生電場(chǎng),驅動(dòng)帶電分子的遷移。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類(lèi)。垂直板式電泳是較為常見(jiàn)的一種,常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板,玻璃板兩邊由塑料條隔開(kāi),在玻璃平板中間制備電泳凝膠,凝膠的大小通常是12cm 14 cm,厚度為1mm~2? mm,近年來(lái)新研制的電泳槽,膠面更小、更薄,以節省試劑和縮短電泳時(shí)間。制膠時(shí)在凝膠溶液中放一個(gè)塑料梳子,在膠聚合后移去,形成上樣品的凹槽。水平式電泳,凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上,用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液,或將凝膠直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會(huì )引起帶電分子電荷的改變,進(jìn)而影響其電泳遷移的速度,所以電泳過(guò)程應在適當的緩沖液中進(jìn)行的,緩沖液可以保持待分離物的帶電性質(zhì)的穩定。
為了更好的了解帶電分子在電泳過(guò)程中是如何被分離的,下面簡(jiǎn)單介紹一下電泳的基本原理。在兩個(gè)平行電極上加一定的電壓(V),就會(huì )在電極中間產(chǎn)生電場(chǎng)強度(E),L是電極間距離。
在稀溶液中,電場(chǎng)對帶電分子的作用力(F),等于所帶凈電荷與電場(chǎng)強度的乘積。這個(gè)作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動(dòng)。在移動(dòng)過(guò)程中,分子會(huì )受到介質(zhì)粘滯力的阻礙。粘滯力(F’)的大小與分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān),并與帶電分子的移動(dòng)速度成正比,對于球狀分子,F’的大小服從Stokes定律,即:F’=6πrηυ式中r是球狀分子的半徑,η是緩沖液粘度,υ是電泳速度(υ= d / t,單位時(shí)間粒子運動(dòng)的距離,cm / s )。當帶電分子勻速移動(dòng)時(shí): F = F’,q?E = 6πrηυ由此可以看出,遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比,與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量時(shí),實(shí)際使用的是相對遷移率mR。帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同,因而在電泳過(guò)程中具有不同的遷移速度,形成了依次排列的不同區帶而被分開(kāi)。即使兩個(gè)分子具有相似的電荷,如果它們的分子大小不同,由于它們所受的阻力不同,因此遷移速度也不同,在電泳過(guò)程中就可以被分離。有些類(lèi)型的電泳幾乎*依賴(lài)于分子所帶的電荷不同進(jìn)行分離,如等電聚焦電泳;而有些類(lèi)型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過(guò)程中產(chǎn)生的阻力不同而得到分離,如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離后的樣品通過(guò)各種方法的染色,或者如果樣品有放射性標記,則可以通過(guò)放射性自顯影等方法進(jìn)行檢測。
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