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蛋白質(zhì)的分離純化方法介紹
更新時(shí)間:2015-05-14 點(diǎn)擊次數:1280

(一)根據配體特異性的分離方法-親和色譜法

親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,它經(jīng)常只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái),而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質(zhì)與另一種稱(chēng)為配體(Ligand)的分子能特異而非共價(jià)地結合。其基本原理:蛋白質(zhì)在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類(lèi)型的細胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì),因此蛋白質(zhì)的分離(Separation),提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學(xué)中的重要的一部分,至今還沒(méi)的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái),因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。

(二)根據蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)。

超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜,而蛋白質(zhì)留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。

2、凝膠過(guò)濾法

也稱(chēng)分子排阻層析或分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質(zhì)混合物zui有效的方法之一。柱中zui常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。

(三)根據蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離

蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數量不同,可將其分開(kāi)。

1、電泳法

各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下,因分子量和電荷數量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開(kāi)。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體,電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí),到達各自等電點(diǎn)的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。

2、離子交換層析法

離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE?FONTCOLOR: black; FONT-SIZE: 10.5pt;">宋體" LANG="ZH-CN">纖維素),當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí),帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。

(四)根據蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

1、蛋白質(zhì)的鹽析

中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著(zhù)影響,一般在低鹽濃度下隨著(zhù)鹽濃度升高,蛋白質(zhì)的溶解度增加,此稱(chēng)鹽溶;當鹽濃度繼續升高時(shí),蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現象稱(chēng)鹽析,將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,使之失水",于是蛋白質(zhì)膠粒凝結并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調節混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。

影響鹽析的因素有:(1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時(shí)溶解度低,更容易鹽析。(2pH值:大多數蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度zui低。(3)蛋白質(zhì)濃度:蛋白質(zhì)濃度高時(shí),欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著(zhù)其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)(共沉現象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋?zhuān)沟鞍踪|(zhì)含量在2.5-3.0%。

蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用zui多的硫酸銨,它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數小而溶解度大(25度時(shí)飽和溶液為4.1M,即767/升;0度時(shí)飽和溶解度為3.9M,即676/升),在這一溶解度范圍內,許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái);另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí),需用硫酸或氨水調節。

蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(常用的是玻璃紙),用緩沖液進(jìn)行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時(shí)間較長(cháng),所以在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25G-50過(guò)柱的辦法除鹽,所用的時(shí)間就比較短。

2、等電點(diǎn)沉淀法

蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力zui小,因而溶解度也zui小,各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別,可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用。

3、低溫有機溶劑沉淀法

用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質(zhì)較易變性,應在低溫下進(jìn)行。

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