摘要：
化學(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光與免疫分析方法相結合，綜合了化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和免疫分析的高選擇性，被廣泛應用到臨床檢測和藥物分析中。隨著(zhù)新的發(fā)光試劑，新固相材料的研制以及新標記技術(shù)應用，化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的靈敏度，重現性將大大提高。

在分析化學(xué)中，化學(xué)發(fā)光是當基態(tài)分子吸收化學(xué)反應中釋放的能量躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式返回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生的光?；诨瘜W(xué)發(fā)光強度和被測物含量之間的關(guān)系建立的分析方法叫化學(xué)發(fā)光分析法，化學(xué)發(fā)光與液相色譜、毛細管電泳、免疫分析等技術(shù)的結合，具有靈敏度高，線(xiàn)性范圍寬，儀器簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，已廣泛地應用于環(huán)境、臨床、食品和工業(yè)分析中。將化學(xué)發(fā)光與免疫分析方法相結合，綜合了化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和免疫分析的高選擇性，近年來(lái)，成為研究的熱點(diǎn)。

1化學(xué)發(fā)光免疫分析的分類(lèi)

化學(xué)發(fā)光免疫分析根據發(fā)光體系應用于免疫分析中的方式不同可分為：直接標記發(fā)光物質(zhì)的免疫分析、酶催化化學(xué)發(fā)光免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。

1．1直接標記發(fā)光物質(zhì)的免疫分析
該方法是用化學(xué)發(fā)光劑直接標記抗原或抗體。常用于標記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類(lèi)化合物，是有效的發(fā)光標記物，其通過(guò)起動(dòng)發(fā)光試劑的作用而發(fā)光，強烈的直接發(fā)光在1S內完成，為快速的閃爍發(fā)光。吖啶酯作為標記物用于免疫分析，其化學(xué)反應簡(jiǎn)單、快速、無(wú)需催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結合少，本底低；與大分子的結合不會(huì )減小所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。張皓等采用直接化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行的全自動(dòng)雙抗夾心免疫測定方法，對130例患者測定血清B—HCG含量法。用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測．HCG，操作簡(jiǎn)便、敏感度高、特異性強，優(yōu)于一般的酶聯(lián)免疫法和放射免疫法，適合于臨床實(shí)驗室推廣使用。

1．2酶催化化學(xué)發(fā)光免疫分析
從標記免疫分析角度，酶催化化學(xué)發(fā)光免疫分析應屬酶免疫分析，只是酶反應的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免疫分析*相同：以酶標記生物活性物質(zhì)(如酶標記的抗原或抗體)進(jìn)行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進(jìn)行發(fā)光測定。目前常用的標記酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，它們有各自的發(fā)光底物。辣根過(guò)氧化物酶常用的底物為魯米諾或其衍生物如異魯米諾，魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進(jìn)行，在過(guò)氧化物酶及活性氧(過(guò)氧化陰離子、單線(xiàn)態(tài)氧、羥自由基、過(guò)氧化氫)存在下，生成激發(fā)態(tài)中間體，當其回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，其波長(cháng)為425nln。鈕心怡等采用特異性的兩株C．P單克隆抗體，辣根過(guò)氧化物魯米諾酶促增敏化學(xué)發(fā)光體系，利用雙抗體夾心法檢測。敏感度為0．102 g／L；檢測線(xiàn)性范圍為0．102～20 L；多人次檢測證實(shí)試劑盒批內變異均小于10％，分析間變異小于15％；與18 g／L人胰島素原、2000mIU／L的人胰島素無(wú)顯著(zhù)交叉反應。

堿性磷酸酶所用底物為環(huán)1，2．二氧乙烷衍生物用于化學(xué)發(fā)光酶免分析底物而設計的分子結構中包含起穩定作用的基團——金剛烷基，其分子中發(fā)光基團為芳香基團和酶作用的基團，在酶及起動(dòng)發(fā)光試劑作用下引起化學(xué)發(fā)光。馮艷銘等_3』采用雙抗體異位點(diǎn)一步夾心法，以甲胎蛋白單克隆抗體作為固相包被，采用改良過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行甲胎蛋白多克隆抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)制備酶標抗體；以金剛烷胺衍生物CSPD作為底物，優(yōu)化CSPD與SapphireII發(fā)光體系用國家標準品校定定量標準品，建立了人血清AFP的化學(xué)發(fā)光免疫定量分析法。利用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，以堿性磷酸酶作為標記物，環(huán)1，2一二氧乙烷衍生物AMPPD為發(fā)光底物，測定血清中的糖抗原50，檢出限為1．0umL～，線(xiàn)性范圍為0～300umL一。

批內精密度<7％，批內精密度為11％。

1．3電化學(xué)發(fā)光免疫分析
電化學(xué)發(fā)光免疫分析的反應在電極表面進(jìn)行，發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕，用另一反應物三丙胺來(lái)激發(fā)光反應。在陽(yáng)極表面，這兩種物質(zhì)可同時(shí)失去電子，發(fā)生氧化反應。在電極板上二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕迅速被氧化成三價(jià)三聯(lián)吡啶釕，與此同時(shí)三丙胺也在電極板上被氧化成三丙胺陽(yáng)離子自由基，三丙胺陽(yáng)離子自由基自發(fā)地釋放一個(gè)質(zhì)子而變成三丙胺非穩定分子，將一個(gè)電子遞給三價(jià)三聯(lián)吡啶釕，形成激發(fā)態(tài)的二價(jià)三聯(lián)吡啶釕。激發(fā)態(tài)的二價(jià)三聯(lián)毗啶釕在衰減的同時(shí)發(fā)射一個(gè)波長(cháng)為620／l／n的光子，重新回到基態(tài)二價(jià)三聯(lián)吡啶釕。這一過(guò)程在電極表面反復進(jìn)行，產(chǎn)生、穩定的連續發(fā)光，并不斷增強。張繼東用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法在檢測乙肝標志物，發(fā)現用電化學(xué)方法檢測，靈敏度更高，專(zhuān)屬性更強。

2新進(jìn)展

化學(xué)免疫分析方法的新進(jìn)展主要表現在新的標記物以及標記技術(shù)的應用，新型固相載體的應用以及聯(lián)用技術(shù)。

2．1新的標記物
近年來(lái)，科學(xué)家們致力于化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的研究，通過(guò)往發(fā)光體系中加入增加化學(xué)增強劑來(lái)增加量子產(chǎn)率以及發(fā)光時(shí)間。同時(shí)一些學(xué)者將目光集中于新的標記發(fā)光物的開(kāi)發(fā)中。并取得了相應成果。目前已證明從棕櫚樹(shù)和大豆中提取的HRP的陰離子型同工酶(HRP2A)在沒(méi)有增強劑的情況下可以、常時(shí)間催化luminol—H2O2體系發(fā)光，并且HRP．A比HRP—C穩定性更好，這在酶標記物的儲存中是非常重要的。而白細胞堿性磷(Leukocyte Alkaline Phosphatase，LAP)與AIJP一樣，也有催化性能，并已用于化學(xué)發(fā)光的檢測。此外，還通過(guò)合成技術(shù)合成了吖啶酯類(lèi)化學(xué)發(fā)光試劑。Zhuang等合成了一種新型雙吖啶化合物：1O，102二甲基23，32二磺基29，9'2二雙吖啶(DMDSBA)，并詳細研究了它的化學(xué)發(fā)光性質(zhì)。DMDSBA被用于標記抗一CEA抗體。標記的比率接近1．15～1．32，平均標記比例是1．25。結果表明，連接到抗一CEA抗體后，標記抗體的免疫反應活性與DMDSBA的量子效率沒(méi)有明顯改變。建立了一種新的夾心化學(xué)發(fā)光免疫方法，測定人血清中CEA的線(xiàn)性范圍為1．0～100ng／mL，檢測限0．53ng／mL。

2．2新標記技術(shù)的應用
固相標記方法的應用，減少游離標記物以及聚合蛋白質(zhì)；納米技術(shù)與生物分析的結合，即利用Au、Ag等陽(yáng)離子對化學(xué)發(fā)光具有催化放大作用，提高檢測靈敏度。HonglanQ等利用電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，將N．氨丁基一N．異魯米諾(ABEI)作為發(fā)光標記試劑標記在金毫微粒改性的石蠟活化的石墨電極上，測定人體[gG。電化學(xué)發(fā)光的強度大大增強，ABEI檢出限為2×10^-14 mol／L(S／N=3)，lgG的檢出限為1×10。g／mL(S／N=3)。線(xiàn)性范圍為3．0×10^-ll～1．0×10^-9g／mL。在濃度為1．0×10^-10／mL時(shí)的RSD為3．1％。說(shuō)明金微?；瘜W(xué)發(fā)光的催化放大作用在化學(xué)發(fā)光免疫分析方法中有很大的應用前景。量子點(diǎn)(quantumdots，QDs)又稱(chēng)半導體納米微晶體，是一種由Ⅱ．Ⅵ族或Ⅲ．V族元素組成的能夠接受激光產(chǎn)生熒光的半導體納米顆粒，直徑約為2～6nm。與CLIA常用標記酶和熒光素相比，QD不易失活，受外部環(huán)境影響小，性質(zhì)穩定，重現性好激發(fā)光譜范圍寬，而發(fā)射光譜窄且對稱(chēng)，是的標記物。

2．3新固相材料的應用
新固相材料主要體現在(1)表面有與蛋白結合的官能團，可以充分固定抗體抗原；(2)表面性質(zhì)要保證不影響結合后蛋白的免疫反應活性；(3)比表面積要足夠大以固定足夠量蛋白(4)應具有親水性以避免與待測物和樣品基質(zhì)的非共價(jià)結合；(5)在載液的沖擊下保持表面的抗體結合活性。目前用于丌．的固相材料主要有尼龍、瓊脂糖凝膠、磁性粒子，以及二氧化硅可控孔度玻璃(Controlled poreglass，CPG)和玻璃微珠_(kāi)IJ等有機硅材料。

2．4與其他技術(shù)聯(lián)用
目前研究zui多的是毛細管電泳一化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(CECLIA)結合了CE對生物樣品分離的分離和CLIA的高靈敏度檢測。王軍華等利用毛細管電泳免疫化學(xué)發(fā)光檢測鼠血管平滑肌細胞中zmol骨形成蛋白．2，采用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化魯米諾．過(guò)氧化氫，以對碘苯酚增強其化學(xué)發(fā)光反應，HRP檢出限為4．4pmol／L(53zmo1)，是目前報道檢測HRP的zui高靈敏度之一。用毛細管電泳化學(xué)發(fā)光免疫方法測定了人血清中乙肝表面抗原和抗體，并與酶免疫分析方法比較，驗證了毛細管電泳化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)用于臨床的可行性。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)是將化學(xué)發(fā)光分析和流動(dòng)注射相結合的一種高靈敏度的微量及痕量分析技術(shù)，其分析速度快、器設備簡(jiǎn)單，是當前分析化學(xué)領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)。利用順序流動(dòng)注射技術(shù)分析非離子型表面活性劑，線(xiàn)性范圍0～1000ppb，zui低檢出限為10ppm每個(gè)樣品的分析時(shí)問(wèn)為15min，已經(jīng)被成功用于河水中anti-ApnEOs的檢測。

3結語(yǔ)

化學(xué)發(fā)光免疫分析方法作為一種高選擇、高靈敏度檢測方法，已經(jīng)被廣泛應用臨床檢測和藥物分析中。隨著(zhù)新的發(fā)光試劑，新固相材料的研制以及新標記技術(shù)應用，化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的靈敏度，重現性將大大提高。各種聯(lián)用技術(shù)的出現，如毛細管電泳一化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的聯(lián)用，大大提高了化學(xué)發(fā)光免疫的選擇性和重現性。被廣泛應用于臨床檢測和藥物分析中，并朝著(zhù)自動(dòng)化、智能化、微型化方向發(fā)展。