隨著(zhù)發(fā)光(luminescence)技術(shù)在多種生物實(shí)驗中的廣泛應用，生物發(fā)光(bioluminescence)技術(shù)越來(lái)越成為的生物檢測手段。在這篇文章中，我們將詳細討論生物發(fā)光技術(shù)在生物檢測中的應用，以及它與其它發(fā)光檢測手段相比所顯示出的優(yōu)點(diǎn)。

1 生物發(fā)光的特點(diǎn)

根據產(chǎn)生光子的能量來(lái)源不同，發(fā)光可分為以下四大類(lèi)，一是熒光(fluorescence)：依靠光子發(fā)光；二是化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)：依靠化學(xué)能量發(fā)光；三是輻射發(fā)光：依靠放射性能量發(fā)光；四是電能發(fā)光：依靠電能量發(fā)光。其中，生物發(fā)光(bioluminescence)是依靠天然的酶促化學(xué)反應產(chǎn)生的能量而發(fā)光，屬于化學(xué)發(fā)光，它天然地存在于許多生物體內，例如螢火蟲(chóng)、深海里的水母和一些細菌。目前，在生命科學(xué)研究中，應用的是熒光和化學(xué)發(fā)光。而生物發(fā)光作為化學(xué)發(fā)光的重要類(lèi)別，也日益受到廣泛關(guān)注和應用。物質(zhì)發(fā)光的機理是：分子首先受到激發(fā)，吸收能量，從穩定的基態(tài)躍遷到不穩定的激發(fā)態(tài)，而當它從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時(shí)，能量就以光子的形式釋放出來(lái)(圖1)，檢測發(fā)出的光子就能確定發(fā)光分子的存在。發(fā)光技術(shù)能否在生物檢測中得到應用及其應用的范圍，在很大程度上取決于激發(fā)分子的能量來(lái)源。因為激發(fā)能量的來(lái)源不同，其產(chǎn)生的相對信號強度(信號對本底的相對值)則不同，對檢測器的靈敏度要求也不同。以生物發(fā)光和熒光為例：對于熒光來(lái)講，一方面，由于熒光的光子能量吸收效率高，分子可以釋放大量的光能，從而產(chǎn)生高強度的光信號，利于檢測；另一方面，這種高流量的激發(fā)光子有時(shí)會(huì )嚴重干擾光感檢測器發(fā)射光子的分析能力，同時(shí)也可能激發(fā)生物樣品本身含有的熒光團，而產(chǎn)生其它非特異的發(fā)射光，進(jìn)而導致實(shí)驗本底過(guò)高。也正是由于熒光的這種特性，即報告基團中高強度的信號與高強度的實(shí)驗本底共存，使得其檢測相對信號強度的能力大大降低。對于生物發(fā)光來(lái)講，它與熒光形成鮮明對照，因為生物發(fā)光依靠天然的酶促化學(xué)反應發(fā)光，不需要引進(jìn)外源的光能，所以應用生物發(fā)光作為檢測手段的報告基團的實(shí)驗本底很底。雖然生物發(fā)光的信號強度沒(méi)有熒光那么高，但由于其*的發(fā)光原理，生物發(fā)光可以比熒光敏感一百甚至一千倍以上。這是生物發(fā)光越來(lái)越成為很多生物研究領(lǐng)域的生物檢測手段的原因之一。

在實(shí)際應用時(shí)，需要反復權衡信號強度的要求和實(shí)驗本底的影響，以選擇*的檢測技術(shù)。在光子檢測能力比較低的情況下，實(shí)驗本底很大程度上取決于儀器檢測的對象，例如顯微鏡和流式細胞儀，由于需要檢測單個(gè)細胞光學(xué)信號的變化，對發(fā)射光信號的強度要求非常高，因此，熒光通常會(huì )成為這一類(lèi)應用領(lǐng)域的。然而，當需要檢測大量的生物樣品的時(shí)候，對光子檢測能力的要求就會(huì )相應降低，對降低實(shí)驗本底的要求相應會(huì )增加，比如在檢測單個(gè)試管樣品、多孔培養板樣品，或者對器官(如老鼠器官)進(jìn)行圖像分析的時(shí)候，生物發(fā)光因其低本底和高靈敏度而倍受歡迎。而且由于生物發(fā)光檢測器不需要使用光學(xué)濾片，從而為縮短樣品和檢測器之間的距離提供了可能，由此也更加提高了檢測的效率。生物發(fā)光的靈敏度可以達到10-20 mol，相當于6，000多個(gè)螢光素酶分子。對于一個(gè)有幾百個(gè)細胞的生物樣品來(lái)說(shuō)，一個(gè)細胞里只要有幾個(gè)分子的螢光素酶就可以被檢測到。而且生物發(fā)光的高靈敏度使得它可以檢測的濃度范圍非常寬，大多數可以跨越6～8個(gè)數量級，而且現代生物發(fā)光檢測儀技術(shù)的更新也使得如此大跨度的檢測成為可能。另外，由于生物發(fā)光來(lái)源于天然生物體內的酶促化學(xué)發(fā)光反應，當將其引進(jìn)生物樣品內的時(shí)候，對正常的生物活動(dòng)不會(huì )添加太多負面影響。而且，因為螢光素酶的底物在反應時(shí)是被包裹在螢光素酶分子的內部，從而可以在zui大限度上保護正常的酶促發(fā)光反應不受外界的干擾。

2 生物發(fā)光作為報告基因的應用及其優(yōu)點(diǎn)

生物發(fā)光在生命科學(xué)研究中zui廣泛的應用是作為監測基因轉錄活動(dòng)的報告基因。其中，螢火蟲(chóng)體內天然存在的螢光素酶通常是研究人員的。螢火蟲(chóng)的螢光素酶是一個(gè)61kDa的單體蛋白，它主要催化作用于名為螢光素(luciferin)的螢光素酶底物，在有ATP和氧氣存在的條件下產(chǎn)生黃綠色的光(發(fā)射光波長(cháng)是560 nm)。

當使用報告基因來(lái)監測基因轉錄活性的時(shí)候，研究人員zui大的顧慮是引進(jìn)外源的報告基因可能會(huì )影響正常的生物活性，尤其是當報告基因通常需要和生物體內自身細胞的分子活動(dòng)相時(shí)，高濃度的外源基因會(huì )過(guò)分加重生物內部細胞活動(dòng)的負擔，從而影響正常的生理活動(dòng)，甚至造成不正常的生理現象。因此，盡量降低報告基因的濃度就成為研究成功的關(guān)鍵。以綠色熒光蛋白為例，它是一類(lèi)天然存在的發(fā)光蛋白，由于它能產(chǎn)生高強度的發(fā)射熒光，所以可以獲得非常清晰、生動(dòng)的顯微圖像，在單細胞生物圖像分析中已經(jīng)得到廣泛應用。但因為清晰圖像的產(chǎn)生通常需要綠色熒光蛋白高濃度表達，從而加重了生物內部細胞活動(dòng)的負擔，使得綠色熒光蛋白不適合作為監測基因轉錄活動(dòng)的報告基因。所以在選擇合適的報告基因時(shí)，特別是和綠色熒光蛋白相比較之后，生物發(fā)光由于其低表達和高靈敏度使其在眾多的選擇中脫穎而出。

監測基因轉錄活性要求報告基因能夠快速監測目標基因細微的動(dòng)態(tài)變化。細胞內報告基因的濃度取決于兩大動(dòng)態(tài)過(guò)程：即蛋白合成過(guò)程(受基因轉錄活性的調控)和蛋白降解過(guò)程。如果蛋白降解過(guò)程很慢，則會(huì )使蛋白高度穩定，從而會(huì )造成蛋白的本底表達水平過(guò)高，那么基因轉錄活性改變所產(chǎn)生的新蛋白的合成就不容易被檢測到。這樣一來(lái)，報告基因的表達就不能準確地反應基因轉錄活性的變化。實(shí)驗證明，在螢光素酶的序列上添加蛋白降解序列，如小鼠鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(mouse ornithine decarboxylase， ODC)中富含脯氨酸- 谷氨酸- 絲氨酸- 蘇氨酸(proline-glutamate-serinethreoninerich，PEST)的序列，可以顯著(zhù)地提高檢測技術(shù)的應答性，并且不會(huì )對檢測手段的靈敏度造成太大影響。與之相反，由于綠色熒光蛋白的高表達和高穩定性，使得添加蛋白降解信號反而在很大程度上限制了檢測的靈敏度。

為了進(jìn)一步提高檢測基因的效率，我們對螢光素酶基因序列的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，使得它在多種哺乳細胞中的表達水平提高了5～10倍；同時(shí)，為了減少對基因的非特異性調控，我們也對螢光素酶的載體進(jìn)行了優(yōu)化，去除了載體上哺乳動(dòng)物轉錄因子結合序列的保守序列，從而大大降低了實(shí)驗的本底，顯著(zhù)提高了實(shí)驗的相對信號強度。優(yōu)化后的螢光素酶報告基因可以成功地應用在各項生物研究領(lǐng)域中，例如對腫瘤壞死因子信號轉導的研究。腫瘤壞死因子是由單核- 巨噬細胞產(chǎn)生的能致腫瘤細胞壞死的活性因子，能加強中性粒細胞的吞噬和消化功能，促進(jìn)其粘附于血管內皮和遷移出血管之外，并能激活轉錄因子NF- B調控的包括IL-1、GM-CSF在內的多種基因的表達。在外源表達NF- B螢光素酶報告基因的HEK293 細胞中，腫瘤壞死因子的刺激可以有效地使螢光素酶的表達提高1000 倍以上。同樣的檢測方法也可以成功地檢測腫瘤壞死因子阻斷劑對腫瘤壞死因子生物活性的阻斷效率(IC50=0.77 nmol)。

3 生物發(fā)光的其它應用

生物發(fā)光的強度取決于酶促化學(xué)反應中的各個(gè)反應成分的濃度，包括熒光素酶濃度、ATP濃度和螢光素酶底物即螢光素的濃度。通常，在生物發(fā)光的檢測體系中，如果保持其它成分的濃度過(guò)量且恒定，就可以檢測與生物活性相關(guān)的某個(gè)特定成分的濃度變化。我們上面談到的用螢光素酶作為報告基因來(lái)監測基因轉錄活性的實(shí)驗，就是把螢光素酶濃度和基因轉錄活性直接關(guān)聯(lián)起來(lái)，螢光素酶濃度是我們的zui終監測目標。此外，如果我們固定螢光素酶的濃度并使其過(guò)量，生物發(fā)光還可以用來(lái)監測與ATP或螢光素濃度相關(guān)的生物學(xué)活性。

通過(guò)檢測螢光素的濃度來(lái)監測某一生物學(xué)活性的實(shí)驗原理是：在螢光素上添加一個(gè)化學(xué)基團進(jìn)行修飾，建立一個(gè)螢光素酶無(wú)法識別的"修飾"底物，而只有通過(guò)特定的生物反應切除這個(gè)化學(xué)基團，螢光素才能恢復活性，酶促反應才能發(fā)生，這樣我們就可以把生物發(fā)光的強度和這個(gè)特定的生物反應起來(lái)。Asp-Glu-Val-Asp-6'-aminoluciferin是一個(gè)沒(méi)有活性的螢光素衍生物，只有當半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)存在并切除這個(gè)四肽的序列，釋放出游離的螢光素時(shí)，螢光素酶酶促反應才能發(fā)生。因為半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的活性是檢測細胞凋亡的一個(gè)重要指標，這樣的設計使生物發(fā)光成為一個(gè)有效的檢測細胞凋亡的手段。當然這一設計也可以用于運用熒光的細胞凋亡檢測上，即把同樣四肽的序列加到熒光染料Rhodamine110上。但由于生物發(fā)光*的低表達和高靈敏度，在相同的實(shí)驗條件下，運用生物發(fā)光研究細胞凋亡，其敏感性比運用熒光技術(shù)高將近一百倍。類(lèi)似的設計也可以用來(lái)利用生物發(fā)光檢測其它蛋白酶的活性，比如caspase-8、caspase-9、二肽基肽酶Ⅵ(DPPIV)、caspase-3、鈣蛋白酶(calpain)、蛋白酶體(proteosome)等，并且還可以檢測其它如CYP450活性、單氨氧化酶等的酶促反應。

生物發(fā)光zui早用于檢測ATP的濃度，并且迄今為止仍然是快速檢測細胞活力zui廣泛使用的方法之一。與基于熒光的細胞活力檢測方法(如使用tetrazolium)相比，用生物發(fā)光來(lái)檢測哺乳細胞的生物活性，其敏感度要高達一百倍以上，而且只需要5 min。用生物發(fā)光來(lái)檢測細菌的生物活性，靈敏度非常高，細菌個(gè)數小于10時(shí)，都可以被檢測到。用生物發(fā)光檢測ATP的方法還可用于檢測消耗ATP的生物酶的濃度。以激酶為例，由于它可以作用于不同的磷酸鹽受體，包括蛋白、脂類(lèi)和多糖底物，這種方法可以作為一個(gè)通用的檢測激酶活性的手段。zui近，我們利用cAMP對蛋白激酶A的調控和蛋白激酶A的激酶反應對ATP的消耗建立了一個(gè)檢測cAMP濃度變化的生物發(fā)光檢測方法。具體來(lái)說(shuō)，細胞內cAMP的濃度可調節蛋白激酶A 的活性，而蛋白激酶A被激活后催化相應的磷酸化反應則需要消耗ATP，這樣一來(lái)細胞內ATP濃度就會(huì )降低，因此，我們檢測到的ATP的濃度就與蛋白激酶A的活性成反比，也與cAMP的濃度成反比。由于我們能夠將生物發(fā)光和ATP濃度直接關(guān)聯(lián)起來(lái)，所以我們建立了一個(gè)細胞內檢測G蛋白-偶聯(lián)受體活性或磷酸去脂酶活性的快速敏感的檢測方法。

4 結語(yǔ)

生物發(fā)光在復雜的生物有機體研究中具有巨大的潛力和價(jià)值。無(wú)論是它在很低的濃度下就可以發(fā)出清晰并定量的信號這一特性，還是它在哺乳細胞中低本底的優(yōu)點(diǎn)，都使得生物發(fā)光技術(shù)在揭示生命奧秘的過(guò)程中擁有*的地位。因此，生物發(fā)光檢測技術(shù)必將在基礎生命科學(xué)研究和新藥開(kāi)發(fā)等諸多領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越強大的作用。