液相色譜柱安裝與使用說(shuō)明
HPLC分析是系統的工作，每個(gè)環(huán)節都很重要；看似簡(jiǎn)單的環(huán)節，反而容易疏忽，引起整個(gè)實(shí)驗的結果偏差，因此養成良好的習慣是很重要的。色譜柱是色譜系統的心臟，液相色譜柱的正確安裝與使用，是色譜工作的關(guān)鍵；也是獲得正確可靠的實(shí)驗數據的必經(jīng)之路。
使用儀器: LC-600液相色譜儀
一·液相色譜柱的安裝
1 液相色譜柱的結構：
a．空柱由柱接頭柱管及濾片組裝而成
柱接頭采用低死體積結構，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英才外螺紋，另一端是3/16英才的內螺紋（國內外已規范化）。7/16英才外螺紋與1/4英寸柱管（￠6.35mm）連接，中間放置壓環(huán)用于密封。3/16英才的內螺紋與1/16英才（￠1.57mm）的連接管連接，之間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時(shí)，用￠1.57mm連接管通過(guò)空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后在擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上（連接管通過(guò)壓環(huán)后露出的管長(cháng)度應嚴格控制在2.5mm長(cháng)或其他固定尺寸。
在兩端柱接頭內，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片（或濾網(wǎng)），用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外流失?？罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內不能長(cháng)時(shí)間存留此類(lèi)溶劑，以避免腐蝕。
b． 柱填料：
液相色譜柱的分離作用是在填料和流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類(lèi)是根據填料類(lèi)型而定。
正相柱：多以硅膠為填料。根據外型可分為無(wú)定型和球型兩種，其顆粒直徑在3-10um的范圍內。另一類(lèi)正相填料是硅膠表面鍵合—CN，—NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團（ODS）的非極性填料。也有無(wú)定型和球型之分。常用的其他反相填料還有鍵合C8，C4，C2，苯基等，其顆粒直徑在3-10um之間。
2 色譜柱的安裝
a． 拆開(kāi)柱包裝盒，確認色譜柱的類(lèi)型，尺寸，出廠(chǎng)日期以及柱內儲存的溶劑。
b． 擰下柱兩端的密封堵頭放回包裝盒備用。
c． 按柱管上標示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過(guò)連接管與進(jìn)樣閥出口連接（如條件允許，建議在柱前使用保護柱）；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為.57mm、內徑為0.1mm-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設法降低柱外死體積。連接管通過(guò)空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止，再用扳手繼續順時(shí)針擰1/4-1/2圈，切記不要用力太大。如色譜柱通過(guò)流動(dòng)相加壓后有漏夜現象，請用扳手順時(shí)針擰1/4圈，直至不漏夜為止。
二·液相色譜柱的使用：
色譜柱在使用前，進(jìn)行的柱的性能測試，并將結果保存起來(lái)，作為今后評價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外做柱性能測試時(shí)是按照色譜柱出廠(chǎng)報告中的條件進(jìn)行（出廠(chǎng)測試所使用的條件是*條件），只要這樣測試的結果才有可比性。
1 樣品的前處理：
a． 使用流動(dòng)相溶解樣品。
b． 使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c． 使用0.45um的過(guò)濾膜除去微粒雜質(zhì)。
2 流動(dòng)相的配置：
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
a． 流動(dòng)相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì )沉淀在柱中（或長(cháng)時(shí)間保留在柱中）。
b． 流動(dòng)相具有一定的惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應（特殊情況除外）。
c． 流動(dòng)相的黏度要盡量的小，以便在使用較長(cháng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(cháng)液壓泵的使用壽命（可運行提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度）。
d． 流動(dòng)相的化學(xué)性質(zhì)要與使用的檢測器相適應。如用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e． 流動(dòng)相的沸點(diǎn)不要太低，負責容易產(chǎn)生氣泡，導致實(shí)驗無(wú)法進(jìn)行。
f． 在流動(dòng)相配置好后，一定進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3 流動(dòng)相流速的選擇：
因柱效是柱中流動(dòng)相線(xiàn)性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求*柱效，使用*流速。對內徑為4.6 mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。
當選用*流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(cháng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強度的方法以縮短分析時(shí)間（如反相柱時(shí)，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。
注意：
1）.由于甲醇的廉價(jià)，對于反相柱推薦使用甲醇體系（必須使用乙腈的除外）。
2）.對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的乙烷做流動(dòng)相，沒(méi)有提純的乙烷不的使用。用水使用超純水（電阻率大于18兆歐），去離子水及雙蒸水中含有酚類(lèi)雜質(zhì)，有可能影響分析的結果。
3）.含水流動(dòng)相在實(shí)驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。加入*，防止細菌的生長(cháng)。
4）.流動(dòng)相要求使用0.45um濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。
5）.使用HPLC級溶劑配置流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(cháng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
4 柱性能的測試：
——啟動(dòng)液相色譜儀：a.流動(dòng)相流速設定為1ml/min。
b．UV檢測器波長(cháng)設定為254nm。
——使用出廠(chǎng)測試時(shí)使用的流動(dòng)相組成及測試樣品。
——記錄并計算測試結果。
上海金鵬分析儀器有限公司
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