生物實(shí)驗離心機的使用方法和注意事項
更新時(shí)間:2012-08-07 點(diǎn)擊次數:2520
離心機是借離心力分離液相非均一體系的設備。根據物質(zhì)的沉降系數、質(zhì)量、密度等的不同,應用強大的離心力使物質(zhì)分離、濃縮和提純的方法稱(chēng)為離心。一般說(shuō),
離心機轉速在20000r/min以上的稱(chēng)為超速離心。離心技術(shù),特別是超速離心技術(shù)是分子生物學(xué)、生物化學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中*的手段。
1924年T.Svedberg和Rinde研制出世界上*臺渦輪超速離心機以來(lái),發(fā)展非常迅速,現在已廣泛地應用到科學(xué)研究和生產(chǎn)的各個(gè)領(lǐng)域?,F在離心機轉頭zui高轉速已達100000r/min,zui大離心力達700000g。
離心機作為一種手段,具有許多優(yōu)點(diǎn)。例如,超速離心可在低溫下操作,保護了生物大分子的活性。制備型的離心機負載量大,一次可分離提純幾克樣品,比層析、
電泳上的樣品量大得多。分析離心機不僅可測物質(zhì)的分子量,還可檢驗物質(zhì)的純度、構象、沉降系數等。因此離心技術(shù)在生物學(xué)研究中占有重要的地位,是分離、純
化細胞、病毒、蛋白、核酸和酶的zui方便zui有效的工具。
?。ǘ╇x心原理
當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動(dòng)時(shí),由于重力場(chǎng)的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重,下沉越快,反之密度比液體小的粒子就會(huì )上浮。微粒在重力場(chǎng)下移
動(dòng)的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān),并且又與重力場(chǎng)的強度及液體的粘度有關(guān)。象紅血球大小的顆粒,直徑為數微米,就可以在通常重力作用下觀(guān)察到它們的
沉降過(guò)程。
此外,物質(zhì)在介質(zhì)中沉降時(shí)還伴隨有擴散現象。擴散是無(wú)條件的的。擴散與物質(zhì)的質(zhì)量成反比,顆粒越小擴散越嚴重。而沉降是相對的,有條件的,要受到外力
才能運動(dòng)。沉降與物體重量成正比,顆粒越大沉降越快。對小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質(zhì)等,它們在溶液中成膠體或半膠體狀態(tài),僅僅利用重力是不可能觀(guān)察到
沉降過(guò)程的。因為顆粒越小沉降越慢,而擴散現象則越嚴重。所以需要利用離心機產(chǎn)生強大的離心力,才能迫使這些微??朔U散產(chǎn)生沉降運動(dòng)。
離心就是利用離心機轉子高速旋轉產(chǎn)生的強大的離心力,加快液體中顆粒的沉降速度,把樣品中不同沉降系數和浮力密度的物質(zhì)分離開(kāi)。離心力(F)的大小取決于離心轉頭的角速度(ω,r/min)和物質(zhì)顆粒距離心軸的距離(r,cm)。它們的關(guān)系是:F=ω2R
為方便起見(jiàn),F常用相對離心力也就是地心引力的倍數表示。即把F值除以重力加速度g(約等于9.8m/s2.)得到離心力是重力的多少倍,稱(chēng)作多少個(gè)g。例如離心機轉頭平均半徑是6cm,當轉速是60000
r/min時(shí),離心力是240000×g,表示此時(shí)作用在被離心物質(zhì)上的離心力是日常地心引力的24萬(wàn)倍。
因此,轉速r/min和離心力g值之間并不是成正比關(guān)系,還和半徑有關(guān)。同樣的轉速,半徑大一倍,離心力(g值)也大一倍。轉速(r/min)和離心力(g值)之間的關(guān)系可用下式換算:
式中:r為半徑(cm),g為離心力(g值)
?。ㄈ┏匐x心機的離心方法
用離心方法分離生物大分子和亞細胞物質(zhì)的基本原理是根據它們在液體介質(zhì)中或者沉降速度不同而形成不同的區帶,或者它們的密度
不同而停留在液體介質(zhì)中不同的位置而把它們一一分開(kāi)。前者是沉降速度法,應用該法時(shí)液體介質(zhì)的zui大密度要小于樣品中zui小顆粒的密度,離心時(shí)選用高轉速和短
時(shí)間;后者是沉降平衡法,應用該法時(shí)液體介質(zhì)的zui大密度要大于樣品中zui小顆粒的密度,離心時(shí)選用較低轉速和較長(cháng)時(shí)間。實(shí)際操作有幾種形式:
1.差速離心這種方法是選擇不同轉速的離心,分別分離各個(gè)不同組分。例如先用低速沉降大顆粒和上清液,在高速離心上清沉降中等顆粒,zui后超速離心上清沉降小顆粒。采用逐級提高離心力分離上情液的方法,把不同大小的顆粒分開(kāi)。
這種方法比較簡(jiǎn)單,方便。分離的組份沉到管底,因此可以迅速濃縮所要的組份,減少體積。但回收率和純度是有矛盾的,要提高回收率,勢必提高轉速或延長(cháng)離心時(shí)間,這樣大小相近的顆粒也會(huì )沉到管底。因此該法多用于粗提純或初步濃縮樣品。
2.速度區帶(或速度梯度)離心本法是將樣品放在一個(gè)連續的密度梯度液體上,通過(guò)離心,大顆粒沉降快,小顆粒沉降慢。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間,相同的顆粒就在同一深度
形成一條帶子,因此把各種組份分開(kāi)來(lái)。它適用于分離密度相同、而大小不同的物質(zhì),如不同的蛋白質(zhì)組份密度都差不多,但分子量不一樣,用本法很容易將其分
開(kāi)。但對密度不同、大小類(lèi)似的物質(zhì)則不易分離。
蔗糖梯度是一種常用的介質(zhì)。用不同濃度的蔗糖溶液(5%-60%)配成梯度,用于梯度離心。再分別進(jìn)行收集處于不同區帶里的各個(gè)組份。
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