1. cDNA產(chǎn)量的很低
可能的原因：
＊RNA模板質(zhì)量低
＊對mRNA濃度估計過(guò)高
＊反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足
＊同位素磷32過(guò)期
＊反應體積過(guò)大，不應超過(guò)50μl

2. 擴增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒(méi)有條帶或條帶很淺
＊zui常見(jiàn)的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系
＊與反應起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)
＊建議在試驗中加入對照RNA
＊*鏈的反應產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴增時(shí)，在總的反應體系中的含量不要超過(guò)1/10
＊建議用Oligo（dT）或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于*鏈合成。由于RNA模板存在二級結構，如環(huán)狀結果，有可能導致GSP無(wú)法與模板退火；或SSⅡ反轉錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。
＊目的mRNA中含有強的轉錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：
a. 將*鏈的反應溫度提高至50℃。
b. 使用隨機六聚體代替Oligo（dT）進(jìn)行*鏈反應。

3. 產(chǎn)生非特異性條帶
＊用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。
＊在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產(chǎn)生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產(chǎn)生。
＊由于mRNA剪切方式的不同，根據選擇引物的不同將導致產(chǎn)生不同的RT-PCR結果。

4. 產(chǎn)生彌散（smear）條帶
＊在PCR反應體系中*鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高
＊減少引物的用量
＊優(yōu)化PCR反應條件/減少PCR的循環(huán)次數
＊在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì )產(chǎn)生非特異性擴增，一般會(huì )顯示為彌散背景。

5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶
＊大多數情況下是由于退火溫度過(guò)低而導致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的
＊對于長(cháng)片段的PCR，建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

6. 在無(wú)反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果
＊通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進(jìn)行體外轉錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除。建議可將*鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。
＊有可能是引物二聚體的條帶

7. 擴增產(chǎn)物滯留在加樣孔中
＊有可能是由于模板量過(guò)高而導致PCR結果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將*鏈結果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴增。
＊另外，在二次PCR時(shí)使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。

8. SSⅢ與SSⅡ有何不同？
＊具有更高的熱穩定性（達50℃）
＊具有更長(cháng)的半衰期（達220分鐘）
＊對PCR無(wú)抑制
＊干冰運輸
＊Tdt活性更低
9. 為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？

ThermoScript如果保存不當會(huì )引起活性很快降低，SSⅢ則更穩定。

10. 為什么使用基因特異性引物（GSP）？
GSP在擴增低豐度的轉錄本時(shí)是的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長(cháng)轉錄本的逆轉錄；隨機引物用于mRNA    片段的逆轉錄。

11. 什么情況下需要使用RNase H？
在*輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時(shí)

12. 根據不同的目的選擇不同的系統：
目的 建議
RT與PCR使用不同的引物
或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶 兩步法RT-PCR系統
高靈敏度 一步法或兩步法RT-PCR系統
高特異性 含有適當的DNA聚合酶的兩步法RT-PCR系統
或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統
高保真度 含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統
長(cháng)的反轉錄結果 通常使用兩步法RT-PCR系統可達到*結果
含Elongase酶的一步法RT-PCR系統

二、Generacer
1. 如何針對Generacer試劑盒設計基因特異性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設計引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：
＊50-70％的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)（Tm）
＊23-28個(gè)堿基長(cháng)度，以提高引物特異性
＊降低3’端GC含量，將引物非特異性結合的可能性降至zui低

2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物？
＊加入Hela對照
＊低質(zhì)量的RNA模板
＊逆轉錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長(cháng)模板cDNA的合成
＊目的基因豐度太低，可以通過(guò)提高PCR的循環(huán)次數來(lái)解決，建議使用巢式PCR
＊目的基因沒(méi)有表達，可以通過(guò)使用兩條GSPs來(lái)分析cDNA中是否含有目的基因
＊目的基因太長(cháng)而不適合進(jìn)行反轉錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來(lái)得到全長(cháng)cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。
＊cDNA模板屬于困難模板，可以通過(guò)以下方法解決：優(yōu)化PCR反應參數及反應體系；降低退火溫度；使用5-10％的DMSO幫助通過(guò)高GC含量區；使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應。

3. RACE的PCR結果有雜帶
RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：
＊GSP與其他cDNA的非特異性結合會(huì )導致在擴增目的產(chǎn)物時(shí)得到無(wú)關(guān)產(chǎn)物。
＊GeneRacer引物和cDNA的非特異性結合會(huì )導致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。
＊RNA降解。
＊PCR管或試劑污染。
注意：雜帶一般是因為沒(méi)有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對照來(lái)確定。

4. 得不到全長(cháng)的5’RACE PCR產(chǎn)物
＊CIP反應后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無(wú)降解。
＊CIP脫磷酸不*，可以增加反應中CIP的量或減少RNA的量。
＊PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。

二、Generacer
1. 如何針對Generacer試劑盒設計基因特異性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設計引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：
＊50-70％的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)（Tm）
＊23-28個(gè)堿基長(cháng)度，以提高引物特異性
＊降低3’端GC含量，將引物非特異性結合的可能性降至zui低

2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物？
＊加入Hela對照
＊低質(zhì)量的RNA模板
＊逆轉錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長(cháng)模板cDNA的合成
＊目的基因豐度太低，可以通過(guò)提高PCR的循環(huán)次數來(lái)解決，建議使用巢式PCR
＊目的基因沒(méi)有表達，可以通過(guò)使用兩條GSPs來(lái)分析cDNA中是否含有目的基因
＊目的基因太長(cháng)而不適合進(jìn)行反轉錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來(lái)得到全長(cháng)cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。
＊cDNA模板屬于困難模板，可以通過(guò)以下方法解決：優(yōu)化PCR反應參數及反應體系；降低退火溫度；使用5-10％的DMSO幫助通過(guò)高GC含量區；使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應。

3. RACE的PCR結果有雜帶
RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：
＊GSP與其他cDNA的非特異性結合會(huì )導致在擴增目的產(chǎn)物時(shí)得到無(wú)關(guān)產(chǎn)物。
＊GeneRacer引物和cDNA的非特異性結合會(huì )導致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。
＊RNA降解。
＊PCR管或試劑污染。
注意：雜帶一般是因為沒(méi)有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對照來(lái)確定。

4. 得不到全長(cháng)的5’RACE PCR產(chǎn)物
＊CIP反應后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無(wú)降解。
＊CIP脫磷酸不*，可以增加反應中CIP的量或減少RNA的量。
＊PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。

三、PCR
在進(jìn)行PCR時(shí)：
＊請確保您沒(méi)有使用過(guò)量的起始DNA或者過(guò)高濃度的引物，也沒(méi)有加入過(guò)量的Mg++
＊請確保您使用了恰當的退火溫度
＊請確保您沒(méi)有使用過(guò)量的DNA聚合酶

四、引物
1. 應該選擇哪種純化方法？
取決于實(shí)驗目的和引物的長(cháng)度
2. 為什么我訂購了50nmol，但是收到卻只有40nmol？
50nmol是起始量
3. 怎樣制備100μM的儲液？
體積（μl）=質(zhì)檢報告上的nmol數目×10
4. 怎樣設計引物？
＊一般長(cháng)度20-30bp；
＊至少50%的GC含量；
＊避免引物二聚體和二級結構；
＊引物對的Tm值應該接近。
5. 引物序列有插入或缺失？
＊使用上游和下游引物多測幾個(gè)克隆。
＊請選擇正確的純化方法。
6. PCR無(wú)結果？
＊請檢查引物設計是否正確；
＊請檢測OD讀數是否正確；
＊做一個(gè)陽(yáng)性對照和一個(gè)陰性對照

"友情提示：
您只要致電：：    61425398   36162366
       
我們可以幫您推薦符合您要求的人體全身肌肉解剖模型JP/11302-1相關(guān)產(chǎn)品！我們同時(shí)提供心肺復蘇模擬人,護理人模型，復蘇模擬人，觸電急救模擬人，骨骼模型，急救模型,心肺復蘇模型，模擬人,急救培訓模型,觸電急救訓練模擬人等醫學(xué)模型和體質(zhì)檢測儀器、運動(dòng)康復儀器、心理藥理實(shí)驗室高設備等儀器。 www.021sos.com