那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下蛋白純化常見(jiàn)問(wèn)題（二）。
Q：Superdex 75( 球蛋白分離范圍 3 – 70 KDA)， Superdex 200 (10 – 600 KDA) 和 Superose 6(5-5000 KDA)，分離范圍有重疊，如何選擇？
A：一般使待分離樣品的分子量位于線(xiàn)性分離范圍中部。根據分子量 Marker 在三種柱子上的表現，三者常規推薦 ：蛋白分子量在 40 kDa 以下 (3 kDa 以上 ) 考慮使用 Superdex 75；40 – 400 kDa的樣品考慮使用 Superdex 200；分離 400 kDa 以上樣品時(shí)，建議選擇 Superose 6 Increase。

Q：脫鹽實(shí)驗中的緩沖液如何選擇？
A：如果我們用緩沖液 A 來(lái)平衡柱子，上樣后，走外水的樣品其實(shí)是跟著(zhù)平衡時(shí)的緩沖液 A 出峰并溶解在其中的（而非*后趕樣品用的洗脫緩沖液）。因此，希望樣品溶解在緩沖液 A 中，就用緩沖液 A 來(lái)平衡柱子。緩沖液的選擇，依據實(shí)驗需求和填料本身耐受性，同時(shí)確保樣品在該緩沖液中穩定存在。通常，使用 10-50 mM 磷酸鈉緩沖液，至少含有 25 mM NaCl 用于避免離子作用的非特異性吸附，中性 pH 7.0 ~ 7.4?；驌]發(fā)性緩沖液如 100 mM 乙酸銨或碳酸氫銨。

Q：純化得到的組分中沒(méi)有或很少目的 His 標簽蛋白，怎么回事？
A：若目的 His 標簽蛋白正常表達（使用抗 His 標簽的抗體進(jìn)行 WB 檢測）且充分釋放至上清中，確認蛋白是流穿還是未被洗脫：
若 His 標簽蛋白流穿 ：
樣品或結合緩沖液的條件不合適，注意螯合劑或強還原劑以及咪唑的濃度。
His 標簽蛋白與填料的結合較弱：降低上樣流速或增加孵育時(shí)間 ；增加標簽 His 的數量（常用 6 – 10 個(gè)）。
His 標簽未充分暴露：在變性條件（4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 鹽酸胍） 下進(jìn)行純化或測試；重新構建克隆，改變 His 標簽的位置。
嘗試其他的金屬離子：如 鋅離子，鈷離子等。
若 His 標簽蛋白未洗脫：
洗脫條件過(guò)于溫和：增加咪唑濃度或降低洗脫 pH（注意：pH降至 4.0 以下時(shí) Ni2+ 會(huì )發(fā)生脫落）。
目的蛋白與填料發(fā)生非特異性疏水或其他相互作用：在洗脫緩沖液中加入非離子型去垢劑（如 2% Triton X-100）或提高 NaCl濃度。
目的蛋白在填料中發(fā)生了沉淀：減少上樣量；使用咪唑線(xiàn)性梯度而不是步級洗脫以降低洗脫得到的蛋白濃度；使用去垢劑或改變 NaCl 濃度；在變性條件 (4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 鹽酸胍 )下洗脫。


以上就是上海金鵬分析儀器有限公司為大家整理總結關(guān)于蛋白純化常見(jiàn)問(wèn)題（二）。
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