那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下關(guān)于蛋白純化經(jīng)驗指南（含避坑清單）：

蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應用中使用廣泛，是一項重要的操作技術(shù)。蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來(lái)，是非常復雜的過(guò)程，有哪些坑，一起來(lái)看看師兄們?yōu)槟闾说穆钒?/p>

蛋白純化原則蛋白純化要利用不同蛋白間內在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來(lái)除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì )有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來(lái)得到重組蛋白。

蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細純化階段二個(gè)階段。一般蛋白純化采用的方法為樹(shù)脂法。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細胞成分如DNA、RNA等分開(kāi)，由于此時(shí)樣本體積大、成分雜，要求所用的樹(shù)脂高容量、高流速、顆粒大、粒徑分布寬，并可以迅速將蛋白與污染物分開(kāi)，必要時(shí)可加入相應的保護劑（例如蛋白酶抑制劑），防止目的蛋白被降解。

精細純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些分子量大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區分開(kāi)來(lái)，要用更小的樹(shù)脂顆粒以提高分辨率，常用離子交換柱和疏水柱，應用時(shí)要綜合考慮樹(shù)脂的選擇性和柱效兩個(gè)因素。選擇性指樹(shù)脂與目的蛋白結合的特異性，柱效則是指各蛋白成分逐個(gè)從樹(shù)脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。

程序分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理、粗分級、細分級三步。

前處理分離純化某種蛋白質(zhì)，首先要把蛋白質(zhì)從原來(lái)的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。為此，動(dòng)物材料應先剔除結締組織和脂肪組織，種子材料應先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質(zhì)的污染，油料種子*好先用低沸點(diǎn)的有機溶劑如乙mi等脫脂。然后根據不同的情況，選擇適當的方法，將組織和細胞破碎。動(dòng)物組織和細胞可用電動(dòng)搗碎機或勻漿機破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當的提取液一起研磨的方法或用纖維素酶處理也能達到目的。細胞的破碎比較麻煩，因為整個(gè)細胞壁的骨架實(shí)際上是一個(gè)借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎細胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細胞破碎后，選擇適當的緩沖液把所要的蛋白提取出來(lái)。細胞碎片等不溶物用離心或過(guò)濾的方法除去。

如果所要的蛋白主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質(zhì)等，則可利用差速離心的方法將它們分開(kāi)，收集該細胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細胞膜或膜質(zhì)細胞器結合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結構解聚，然后用適當介質(zhì)提取。

粗分離當蛋白質(zhì)提取液（有時(shí)還雜有核酸、多糖之類(lèi)）獲得后，選用一套適當的方法，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開(kāi)來(lái)。一般這一步的分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過(guò)濾、凝膠過(guò)濾、冷凍真空干燥或其他方法進(jìn)行濃縮。

細分離
樣品經(jīng)粗分級分離以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進(jìn)一步純化，一般使用層析法包括凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳法，包括區帶電泳、等電點(diǎn)聚焦等作為*后的純化步驟。用于細分級分離的方法一般規模較小，但分辨率很高。

結晶是蛋白質(zhì)分離純化的*后步驟。盡管結晶過(guò)程并不能保證蛋白一定是均一的，但是只有某種蛋白在溶液中數量上占有優(yōu)勢時(shí)才能形成結晶。結晶過(guò)程本身也伴隨著(zhù)一定程度的純化，而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白。由于結晶過(guò)程中從未發(fā)現過(guò)變性蛋白，因此蛋白的結晶不僅是純度的一個(gè)標志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。

離子層析法當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH等辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。

有機溶劑提取蛋白質(zhì)純化有機溶劑提取的原理是：與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著(zhù)降低；而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質(zhì)沉淀的有機溶劑的濃度不同，因此，控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì)。

例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白。由于在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的沉淀，而且伴隨著(zhù)變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然后在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過(guò)高,蛋白質(zhì)變性問(wèn)題就可以很大程度上得到解決。對于一些和脂質(zhì)結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶于水的蛋白質(zhì),可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取mian yi球蛋白*早由Cohn于1949年提出,用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是WHO規程和中國生物制品規程推薦的方法,不僅分辨率高、提純效果好、可同時(shí)分離多種成分,而且有抑菌、清理和滅病毒的作用。

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