WB實(shí)驗中化學(xué)發(fā)光成像系統的使用
更新時(shí)間:2021-02-27 點(diǎn)擊次數:7747
那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下WB實(shí)驗中化學(xué)發(fā)光成像系統的使用:
一般的WB檢測過(guò)程中,都會(huì )有膜的封閉、一抗孵育、二抗孵育和底物顯色這四道“加工”工序。后面的底物顯色是關(guān)鍵的一部,也是有文章可作的一個(gè)部分。
WB顯色的方法主要有放射自顯影、底物化學(xué)發(fā)光ECL、底物熒光ECF和底物DAB呈色四種方法,發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL,操作比較簡(jiǎn)單,只需要購買(mǎi)現成的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒即可。試劑盒中一般使用的反應底物A和B分別是魯米諾(又名發(fā)光氨) 和過(guò)氧化氫,原理如下(二抗用HRP標記):在HRP的催化作用下,魯米諾與過(guò)氧化氫反應生成一種過(guò)氧化物,過(guò)氧化物不穩定隨即分解,形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體,當后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài),就會(huì )產(chǎn)生熒光,可用X膠片和成像設備進(jìn)行檢測。使用傳統的X膠片顯影方法進(jìn)行WB實(shí)驗時(shí),后面需要使用暗室曝光來(lái)進(jìn)行ECL檢測,但是建造暗室浪費空間,在暗室中曝光步驟繁瑣,沖洗X光片時(shí)會(huì )接觸有毒的化學(xué)藥劑?;瘜W(xué)發(fā)光成像設備能夠對ECL發(fā)光直接成像,獲得實(shí)驗結果,避免暗室曝光的不便。
是否能夠拍攝到ECL的圖像主要取決于設備是不是帶有制冷的CCD,只有制冷的CCD才夠靈敏地捕捉到膜上發(fā)出的光。隨著(zhù)Cooled-CCD技術(shù)的發(fā)展,成像系統成本越來(lái)越低,因而在現在的實(shí)驗室里這些設備越來(lái)越普遍。本實(shí)驗室目前采用的是化學(xué)發(fā)光成像系統,具有靈敏度高,成像速度快、成像效果清晰等優(yōu)點(diǎn)。
該儀器的使用非常簡(jiǎn)單:
1)在使用前開(kāi)機預冷,待儀器溫度降到-20℃才可以進(jìn)行檢測;
2)將化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒中的A和B按照1:1混合;
3)PVDF膜正面朝上放于暗箱,用移液槍將發(fā)光液均勻地涂在膜上,關(guān)閉暗箱箱門(mén),進(jìn)行曝光;
4)曝光可以自動(dòng)曝光,也可手動(dòng)曝光,一般先點(diǎn)擊自動(dòng)曝光,觀(guān)察成像效果,若不理想可再手動(dòng)調節曝光時(shí)間;另外該儀器還具有多張拍攝模式,可將一張膜在不同的曝光時(shí)間下連拍6張,使曝光更方便。內參一般顯影15s(影像條帶粗細深淺一致說(shuō)明內參已調齊),內參好說(shuō)明各步實(shí)驗操作均無(wú)誤,即可進(jìn)行后續的目的蛋白檢測,目的蛋白結果的好壞就取決于其表達量以及抗體的特異性和效價(jià)了。 與X膠片相比,化學(xué)發(fā)光成像系統具有瞬時(shí)影像處理、立即輸出、不需要膠片處理裝置及暗室等成本花費、可用軟件半定量分析等優(yōu)點(diǎn),因而在現在的實(shí)驗室里化學(xué)發(fā)光成像系統的使用已經(jīng)逐漸取代傳統的暗室壓片曝光檢測。
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