出現非特異性擴增帶
PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不*互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數 過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì )出現非特異性擴增。其對策有：必要時(shí)重新設計引 物。減低酶量或調換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
 
出現片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時(shí)出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數過(guò)多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數。
 
克隆PCR產(chǎn)物1)克隆PCR產(chǎn)物的優(yōu)條件是什么？
摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4℃過(guò)夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì )自連，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫1小時(shí)能滿(mǎn)足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4℃過(guò)夜。
 
2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會(huì )產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。
 
3)如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對照實(shí)驗？
A）涂布未轉化的感受態(tài)細胞。
如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。
B）轉化完整質(zhì)粒，計算菌落生長(cháng)數，測定轉化效率。
例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉化率為： 產(chǎn)生菌落的總數/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞
如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉化率太低。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標準好無(wú)核酸酶污染，不應用其它來(lái)源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的實(shí)驗步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍斑, 沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。
 
4)對照實(shí)驗結果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗出了什么問(wèn)題？
A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿(mǎn)足大多數克隆，為提率，需4℃過(guò)夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過(guò)度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過(guò)度照射會(huì )產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無(wú)A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。
E）高度重復序列可能會(huì )不穩定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

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