凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)-實(shí)驗(yàn)操作方法
更新時(shí)間:2016-12-07 點(diǎn)擊次數(shù):1827
1.探針的標(biāo)記:
(1) 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系:
待標(biāo)記探針 (1.75pmol/微升) 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升
T4 Polynucleotide Kinase (5-10U/微升) 1微升
總體積 10微升
按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑,加入同位素后,Vortex混勻,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混勻。
(2) 使用水浴或PCR儀,37℃反應(yīng)10分鐘。
(3) 加入1微升探針標(biāo)記終止液,混勻,終止探針標(biāo)記反應(yīng)。
(4) 再加入89微升TE,混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上,即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn),通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率。
(5) 標(biāo)記好的探針立即使用,zui長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。
2.探針的純化:
通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn),可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時(shí)候,純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化,可以按照如 下步驟操作:
(1) 對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針,加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨,再加入2體積即200微升的無(wú)水乙醇,混勻。
(2) 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí),或在-20℃沉淀過(guò)一夜。
(3) 在4℃,12000g-16000g離心30分鐘。小心去除上清,切不可觸及沉。
(4) 在4℃,12000g-16000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀,但不宜過(guò)分干燥。
(5) 加入100微升TE,*溶解沉淀。標(biāo)記好的探針立即使用,zui長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天。標(biāo)記好的探針可以保存于-20℃。